- گذاشتن بر روی یخ به مدت ۱۰ دقیقه.
- میکروفیوژ در rpm13000 به مدت ۵ دقیقه.
- انتقال محلول رویی به میکروتیوب ۲میلی لیتر جدید.
- میکروفیوژ در rpm13000 به مدت ۱۰ دقیقه.
- انتقال محلول رویی به دو میکروتیوب ۵/۱ میلی لیتر
- افزودن (۶۶/۰حجم) ایزوپروپانول سرد (۲۰-درجه) به هر تیوب.
- ۱۰ بار اینورت کردن به آرامی.
- گذاشتن تیوب ها در فریزر ۲۰- درجه به مدت ۳۰ دقیقه.
- سانتریفیوژ دو تیوب در rpm13000 به مدت ۱۰ دقیقه.
- اوت محلول رویی، افزودن ۵۰میکرولیتر اتانول ۷۰% به هر میکروتیوب و ۵ بار ضربه زدن با انگشت به آرامی.
- سانتریفیوژ در rpm13000 به مدت ۳ دقیقه.
- کشیدن تمامی محلول رویی با سمپلر و بازگذاشتن درب هر میکروتیوب به مدت ۲ دقیقه در دمای اتاق.
- افزودن ۵۰میکرولیتر آب مقطر به هر میکروتیوب و حل کردن رسوب در آن.
- یکی کردن محتویات دو میکروتیوب، افزودن ۱میکرولیتر محلول RNase(mg/ml10) به نمونه حاصله و ۵ بار ضربه زدن با انگشت به آرامی.
- انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه به مدت ۱۵ دقیقه.
۳-۷- الکتروفورز
برای مشاهده اسیدهای نوکلئیک، ساده­ترین و رایج­ترین راه الکتروفورز بوده که طی آن، اسیدهای نوکلئیک در یک میدان الکتریکی، از قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت می­ کنند. دلیل این امر نیز شارژ منفی آنها به خاطر گروه ­های فسفات موجود درآنها است. علاوه بر آن، یک ماتریکس واجد منافذ با اندازه­ های معین نیز لازم است تا اسیدهای نوکلئیک را بر اساس اندازه شان عبور دهد. در این ماتریکس، مولکول­های با اندازه بزرگ­تر کندتر و مولکول­های با اندازه کوچکتر سریع­تر از داخل این منافذ عبور می­ کنند.

۳-۷- ۱ طرز تهیه ژل آگارز
برای الکتروفورز نمونه­های DNA، عموماً از الف) ژل آگارز و ب) بافر TBE استفاده شد.
بافر TBE، برای ساختن ژل و سیال هادی جریان الکتروفورز استفاده ­گردید.
۳-۷-۲ طرز تهیه بافر (۱X)TBE

مواد مذکور را در ۸۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و سپس با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰میلی لیتر رسانده شد.
لازم به ذکر است که می­توان از بافر TBE (0.5X) نیز برای الکتروفورز استفاده کرد. به شرط آنکه ژل آگارز را نیز با همان غلظت از بافر TBE تهیه نمود که در این پایان نامه نیز تمامی ژل­های آگارز با TBE (0.5X) ساخته شد.
قبل از تهیه ژل آگارز، سینی مخصوص ژل را آماده و شانه مخصوص در سینی قرار داده شد. فاصله شانه تا کف سینی معمولاً باید ۲ تا ۳ میلی متر باشد. سپس بسته به ظرفیت سینی ژل برای ایجاد چاهک مناسب( مثلاً در اینجا ۴۰میلی لیتر) ، مقدار ۴/۰ گرم پودر آگارز را در ۴۰ میلی لیتر بافر TBE حل شد تا ژل ۱% فراهم شود. سپس روی شعله متوسط حرارت داده تا پودر آگارز حل شد و محلول کاملاً شفاف شد. حال کمی صبر کرده تا محلول کمی سرد شده(حدود ۵۵ درجه) و سپس ۱میکرولیتر از رنگ اتیدیوم بروماید(mg/ml10) به آن افزوده شد، ۱۰ بار بصورت عدد ۸ لاتین هم زده و در سینی ژل دارای شانه ریخته شد تا سرد شود. پس از اطمینان از بسته شدن کامل ژل، به آرامی شانه را از داخل آن درآورده و سینی حاوی ژل داخل تانک الکروفورز قرار داده شد. سپس ۵میکرولیتر از نمونه را با ۱میکرولیتر از لودینگ دای (X6) مخلوط و به آرامی از بالای چاهک به داخل آن ریخته شد.
۳-۸- بررسی بیان پروتئین porA با روش SDS-PAGE
یکی از روش های بررسی بیان پروتئین ، روش SDS-PAGE است که برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین مورد استفاده است. SDS-PAGE براساس روش پیشنهادی لاملی (۱۹۷۰) انجام گرفت. برای این منظور از استوک باکتری (که روش تهیه آن را در بالا توضیح داده شد) روی محیط کشت جامدال بی آگار حاوی امپی سیلین کشت خطی داده شد و در انکوباسیون ۳۷ درجه به مدت ۱۸ ساعت انکوبه گردید. سپس ۵ کلنی از پلیت تازه رشد کرده به ۲۰میلی لیتر ال بی براث آمپی سیلین دار تلقیح گردید و در انکوباتور شیکردار در دمای ۳۷ درجه ی سانتیگراد با دور rpm170 قرار گرفت. بعد از ۴ ساعت و پس از آنکه OD به ۸/۰رسید به آن IPTG اضافه شد( به ازای هر ۱میلی لیتر محیط کشت به ان ۲ میکرولیتر IPTG اضافه شد)سپس در همان لحظه یعنی ساعت صفر ۲ میلی لیتر از محتوای فلاسک در شرایط استریل به میکروتیوپ ۲ میلی لیتری انتقال داده شد. بعد نمونه درrpm 13000 به مدت ۵ دقیقه میکروفیوژ شد و محلول رویی کاملا تا قطره اخر دورریخته شد ورسوب به عنوان پروتئین تولید شده در ساعت صفر به یخچال منتقل شد و فلاسک ارلن مایر روی شیکر انکوباتور قرار گرفت.این کار(رسوب گیری باکتری هر ۱ ساعت یکبار) در ۵ ساعت متوالی انجام شد و به عنوان رسوب تولید شده ی باکتری در ساعات اول و دوم و سوم و چهارم و پنجم در نظر گرفته شد. حال برای بررسی بیان پروتئین در این ۵ ساعت ، روی ژل پلی اکریل آمید( SDS-PAG)
به شرح زیر الکتروفورز گردید.
-الکترفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید- SDS-PAG
۳-۹- نحوه آماده سازی جایگاه ژل
پس از آماده سازی صفحات شیشه ای ،صفحات با گیره های مخصوص بسته شد و به صورت عمودی در محل نگه دارنده ی صفحات قرار گرفت.سپس برای تهیه ی ژل SDS-PAGE به سه نوع بافر که در زیر ذکر شده است نیاز است.
بافرهای مورد نیاز: در این روش به سه نوع بافر نیاز است:
الف) بافرجدا کننده ۱۲% :اجزا و مقادیر این بافر در جدول۳-۱ نشان داده شده است.
ب)بافر متراکم کننده ۶%: اجزا و مقادیر این بافر در جدول ۳-۲ نشان داده شده است.
ج)بافر تانک برای برقراری جریان:اجزا و مقادیر این بافر در جدول۳-۳ نشان داده شده است.
۳-۱۰- روش تهیه بافر جداکننده
ابتدا به استوک آکریل آمید و بیس آکریل آمید آماده شده تریس و SDS و آمونیوم پرسولفات (APS)به مقدار اشاره شده در جدول ۳-۱ اضافه شد ، سپس حجم محلول با ۸/۴ میلی لیتر آب مقطر به ۱۵ میلی لیتر رسانده شد و در آخر تمد^[۴۶] به مقدار ذکر شده در جدول۳-۱ اضافه گردیدپس از ترکیب مواد زیر، بافر جدا کننده حاصل شده توسط سمپلر در محل موردنظر (بین صفحات شیشه ای)قرار گرفت . پس از قرار گیری بافر جدا کننده بین صفحات شیشه ای ۱۵ دقیقه برای سفت شدن کامل ژل، فرصت داده شد.