نمودار ۳-۱۵: تغییرات میزان MDAدر اندام هوایی گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE میباشد. اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنیدار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام بهتنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
۳-۲-۵ بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا
نتایج حاصل از اثر تنش مذکور بر میزان پروتئین کل در گیاه کلزا در نمودار (۳-۱۶) به ثبت رسیده است. این آزمایش بر روی کل گیاهچه (Seedlings) انجام گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش این پارامتر در گیاه کلزا ارقام اکاپی (حساس به خشکی) و زرفام (مقاوم به خشکی) طی تنش خشکی با مانیتول ۲۰۰ میلی مولار میباشد. . به طوریکه در رقم زرفام در طی ۳ ساعت بیشترین و در رقم اکاپی در طی ۱۲ ساعت بیشترین مقدار پروتئین مشاهده گردید.
نمودار (۳-۱۶): تغییرات میزان پروتئین کل در گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE میباشد.
اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنیدار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام بهتنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
۳-۲-۶ بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا
نتایج حاصل از بررسی میزان قندهای محلول در نمودار (۳-۱۷) منعکس شده است. این آزمایش بر روی کل گیاهچه (Seedlings) انجام گرفت. در بررسیهای انجام یافته مشخص شد که میزان قندهای محلول عموما تحت تنش خشکی با مانیتول ۲۰۰ میلی مولار در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) بالا رفته، به طوریکه این افزایش در رقم اکاپی بیشتر مشهود بود. در رقم زرفام میزان این پارامتر بهتدریج افزایش یافته که در طی ۱۲ ساعت به بیشترین مقدار خود رسیده و همچنین در رقم اکاپی در طی ۱۲ ساعت بیشترین میزان قندهای محلول مشاهده گردید.
نمودار (۳-۱۷): تغییرات میزان قندهای محلول در گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE میباشد. اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنیدار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام بهتنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
فصل چهارم:
بحث و بررسی
۴-۱- بررسیهای انجام شده در سطح مولکولی
پروتئینکیناز آنزیمی است که با افزودن گروه فسفات (فسفوریلاسیون) به پروتئینها در آنها تغییر ایجاد میکند. معمولاً فسفوریلاسیون با تغییر فعالیت آنزیمی، موقعیت سلول و یا همکاری با دیگر پروتئینها باعث تغییر در عملکرد پروتئین هدف (سوبسترا) میگردد. ژنوم انسان حدوداً دارای ۵۰۰ ژن پروتئینکیناز است. پروتئینکینازها همچنین در باکتریها و گیاهان نیز یافت شدهاند (Manning and Whyte, 2002). ژن پروتئینکیناز(Protein Kinase) نقش قابل توجهی را در شرایط استرس به ویژه در گیاهانی مانند مدل گیاهی آرابیدوپسیس، تنباکو و برنج ایفا می کند. این ژن در تنظیم جنبه های کلیدی اعمال سلولی از جمله تقسیم سلولی، متابولیسم و پاسخ به محرکهای خارجی دخالت داردHrabak, 2000) ). آنالیز مقایسه ای B.napus با آرابیدوپسیس نه تنها بهخاطر درک شباهت ژنومیکی در بین دو گونه، بلکه نیز به دلیل کشف ژنهای مهم برای مهندسی ژنتیک B.napus کاملا سودمند میباشد. نتایج نشان داده است که شباهت قابل توجهی بین دو ژنوم در پاسخ به تنشهای غیرزیستی وجود دارد. ژنهایی مانند پروتئینکیناز در B.napus که در پاسخ به تنشهای غیرزیستی عمل می کنند مشابه با ژن پروتئینکیناز موجود در آرابیدوپسیس تنظیم بالایی دارند et al., ۲۰۱۰) Chen ). ژن پروتئینکیناز توسط تنشهای خشکی، شوری و ABA القاء شده که پیشنهاد می کند این ژن نقش مهمی در مسیر Signal transduction در ارتباط با تنشهای غیرزیستی و ABA در B.napus بازی می کندet al., ۲۰۱۰) Chen ).
بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه، در گیاهچههای (Seedlings) 8 روزهی کلزا رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن پروتئینکیناز(PK) نسبت به کنترل (زمان صفر) به طور معنیداری افزایش یافته، به طوریکه بیشترین میزان بیان را در ۱۲ ساعت و کمترین بیان را در ۳ ساعت نشان داد. اما در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن PK نسبت به زمان کنترل کاهش معنیداری داشته و در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد.
Chen و همکاران ( (۲۰۱۰با بررسی روی کلزا رقم Zhongyou 821 بیشترین میزان بیان این ژن را طی ۲۴ ساعت در ریشه کلزا نشان دادند. آنها مشاهده نمودند که این ژن در بافت گل در بالاترین سطح، اما در سایر بافتها در سطح متوسط یا پائینی بیان شده است. به طوریکه بعد از گلها در ساقه بیشترین بیان را داشته، در ریشه به مقدار کمی بیان شده و در برگ اصلا بیان نمی شود. آنها همچنین دریافتند که این ژن تحت تنش شوری با NaCl 150 میلی مولار و تنش ABA 100 میکرو مولار، ۶ ساعت بعد از شروع تیمار بیشترین بیان را نشان داده است. نتایج جالبی از این پژوهش بدست آمده است که نشاندهنده ارتباط معنیدار بین بیان ژن در دو رقم حساس و مقاوم به خشکی میباشد. همانطوریکه در بالا ذکر شد بیشترین بیان در ۱۲ ساعت در رقم اکاپی با کمترین بیان در ۱۲ ساعت در رقم زرفام همراه میباشد. این پیشنهاد می کند که ژن PK در رقم مقاوم زرفام به طور منفی و در رقم حساس اکاپی به طور مثبت تنظیم می شود.
گیاهان اغلب در طول رشد و نمو خود تحت تاثیر تنشهای مختلفی قرار گرفته و ژنهای دفاعی آنها در فرایند پاسخ به تنش درگیر هستند. فسفریلاسیون/دفسفریلاسیون پروتئین یک مکانیسم تنظیمکنندگی در کنترل فعالیت این ژنهای دفاعی است. آبشار پروتئینکیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مهمترین مسیرهای فسفریلاسیون بوده که در پائیندست سنسورها/ رسپتورها عمل می کند و پاسخهای سلولی را نسبت به محرکهای داخلی و خارجی تنظیم می کند al., ۲۰۰۷) .(Wang et آبشار MAPK دارای سهجزء سیگنالینگ کینازی بوده که به طور فراوانی در بین یوکاریوتها محافظت شده و واسطههای مهمی در مسیر Signal transduction در سلولها هستند. مطالعات زیادی اثبات کرده اند که MAPKها نقش مهمی در تنظیم پاسخ به تنش و نمو گیاه بازی کرده و میتوانند توسط انواعی از تنشهای زیستی و غیرزیستی، از جمله خشکی، شوری، سرما، پاتوژنها و ABA فعال شوندet al., ۲۰۱۰) Chen). MAPKهای یوکاریوتی در پائیندست MAPK کینازها (MAPKK) و MAPKK کینازها (MAPKKK) در آبشارهای معکوس فسفریلاسیون برای تبدیل سیگنالهای خارج سلولی به پاسخهای سلولی عمل می کنند. در حالیکه این رویدادها سیگنالهای ویژهای را تقویت کرده، آنها همچنین سیگنالهای مختلف را بهواسطه Cross-talk از طریق کمپلکسهای خیلی منظم یکپارچه می کنند. بسیاری از سوبستراهای مهم برای MAPKها فاکتورهای نسخهبرداری بوده که بیان ژنهای پائیندست را کنترل می کنند (Petersen .(et al., ۲۰۰۰ موتانت خنثی MAP4K (Atmpk4) آرابیدوپسیس عمدتا پاسخهای دفاعی با واسطه -SA را بیان کرده و مقاومت افزایش یافتهای را نسبت به پاتوژنهای بدخیم نشان میدهد، اما نمیتواند بیان ژنهای نشانگر دفاعی در مسیرهای JA/ET را القاء کرده و سبب افزایش حساسیت نسبت به پاتوژن نکروتروفیک A.brassicicola شود. در توتون، MPK4 (NtMPK4) در سیگنالینگ JA و پاسخ به ازن و همچنین حمله علفخواری دخیل میباشد. برعکس MPK4، برخی از MAPKها نقش مثبتی را در تنظیم پاسخهای دفاعی بیماری وابسته به پاسخهای حساسیت بالا (HR) و مقاومت اکتسابی سیستمیک SAR)) بازی می کنند .(Wang et al., ۲۰۰۹) تاکنون تحت تیمار با تنشهای غیرزیستی، مطالعه ای روی ژن MAPK4 صورت نگرفته است. در این مطالعه، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن MAPK4 نسبت به کنترل (زمان صفر) به طور معنیداری افزایش یافته، به طوریکه بیان آن با گذشت زمان افزایش یافته و ماکزیمم بیان آن ۱۲ ساعت پس از شروع تیمار بوده و کمترین بیان را بعد از کنترل در ۳ ساعت نشان داد. ولی در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن MAPK4 نسبت به زمان کنترل کاهش معنیداری داشته و در طی ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد. جالب است که AtMPK4 بهطور منفی توسط تنشهای زیستی و به طور مثبت توسط تنشهای غیرزیستی تنظیم میشوند (Yu et al., ۲۰۰۵). پاسخ MPK4 به هورمونهای گیاهی اکسین، سیتوکینین، براسینواستروئید، جیبرلین و آبسیزیک اسید مشاهده نشده است .(Petersen et al., ۲۰۰۰) مشاهده کرده اند که بیان BnMPK4 در پاسخ به قارچ Sclerotinia sclerotiorum در رقم مقاوم Zhongshuang9 تنظیم بالایی و در رقم ۸۴۰۳۹ (حساس به قارچ) بعد از گذشت ۶ ساعت از شروع مایه کوبی تنظیم پائینی نشان داد .(Wang et al., ۲۰۰۹) نتایج بدست آمده در این پژوهش حاکی از آن است که سطح بیان ژن MPK4 در دو رقم اکاپی و زرفام متفاوت بوده و پیشنهاد می کند که خواص تنظیمکنندگی این ژن در دو رقم عکس هم میباشند.
تحت تنشهای محیطی، گیاهان شبکه های سیگنالی پیچیدهای را برای درک سیگنالهای مجیطی و سازگاری به شرایط نامطلوب توسعه دادهاند. پژوهشهای اخیر در مخمر، پستانداران و گیاهان، نشان دادهاند که مسیرهای سیگنالی MAPK یکی از مهمترین و حفاظتشدهترین روشها برای کنترل پاسخهای سلولی و رشد میباشند. چندین MAPK از قبیل AtMPK3، AtMPK4 و AtMPK6 توسط تنشهای زیستی و غیرزیستی فعال میشوند. پروتئین BnMPK3 ترکیبی از ۳۷۱ اسید آمینه بوده که همولوژی بالایی با AtMPK3 (۹۴ درصد تشابه) و MmERK2 (۵۶/۵۰ درصد) دارد. مشابه با AtMPK3 و سایر پروتئینکینازهای فعال شده با میتوژن، BnMPK3 شامل یک موتیف آمینواسیدی حفاظت شده T196XY198 (X هر نوع آمینواسیدی می تواند باشد) بوده، که توسط MAPKها و دمین CD (دمین اتصالی مشترک)، که در ناحیه C- ترمینال خود، که بهعنوان مکان اتصالی برای MAPK ها عمل می کند، فسفریله می شود.
بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژنMAPK3 به طور معنیداری افزایش یافته، به طوریکه بیشترین میزان بیان در طی ۲۴ ساعت مشاهده گردید. همچنین در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژنMAPK3 نسبت به زمان کنترل افزایش معنیداری داشته و در طی ۳ ساعت بیشترین سطح بیان را نشان داد. در مطالعه(Yu et al., ۲۰۰۵) پاسخ BnMPK3 به مانیتول ۲۰۰ میلی مولار، ۵ دقیقه بعد از اعمال تیمار شروع شده و سپس به اوج رسید، اما به نظر رسید که منحنی بیان آن در نوسان بوده و به طور واضحی پس از ۶ ساعت کاهش یافت. پاسخ BnMPK3 به Nacl ۱۰۰ میلی مولار پس از طی ۲ دقیقه شروع شده و بعد از ۱ ساعت به بالاترین سطح رسیده و پس از ۲۴ ساعت کاهش پیدا کرد. آنها همچنین دریافتند که بیان BnMPK3 توسط SA (سالیسیلیک اسید) و m-JA (متیل ژاسمونات) تنظیم بالایی نشان داده، که معمولا در عرض ۲۰ دقیقه پس از اعمال تیمار افزایش یافت، به ویژه m-JA که به طور مداوم بیان آن افزایش نشان داد. (Yu et al., ۲۰۰۵) برای درک عملکرد BnMPK3 تحت تنشهای مختلف، BnMPK3 را به درون سویهای از مخمر انتقال (Transform) کرده و برای بررسی بیان بالای BnMPK3 در مخمر، از تیمار داروی پراکسیداسیون چربی tBuooH و تیمار اسمزی مانیتول استفاده گردید که در نتیجه در مخمرهای تراریخت نسبت به سلولهای کنترل تحمل به مانیتول و tBuooH به ویژه در هنگام اعمال غلظت بالای مانیتول (۶۰۰ میلی مولار) بیشتر مشاهده گردید.
تا به امروز چندین ژن از خانواده ژنومی شناسایی شده اند که میزان بیان آنها نسبت به اکسین تغییر می کند. در بسیاری از موارد، این ژنها نه تنها به اکسین بلکه به سایر عوامل القاکننده نیز پاسخ می دهند .(Ogbourne and Antalis, 1998) در سالهای اخیر، پیشرفتهای قابلتوجهی در روشنساختن مسیر Signal transduction اکسین صورت گرفته است. هماکنون شواهد قوی وجود دارد که تنظیم بیان ژن اکسین تحتتاثیر سایر مسیرهای سیگنالی قرار میگیرد. این شواهد عمدتا از خصوصیات موتانتهای پاسخدهی به اکسین بدست آمده است و نشان میدهد که سیگنالینگ اکسین بهواسطه تخریب پروتئین از طریق مسیر پروتئازوم / یوبی کوئیتین، فسفریلاسیون پروتئین، نور و سایر هورمونها تحتتاثیر قرار میگیرد .(Hagen and Guilfoyle, 2002)
در این مطالعه، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن Auxin responsive protein نسبت به کنترل (زمان صفر) به طور معنیداری افزایش یافت. پس از شروع تیمار، بیان این ژن بهتدریج بالا رفته به طوریکه بیشترین میزان بیان را در ۲۴ ساعت نشان داد. با این حال در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن Auxin responsive protein پس از شروع تیمار، بهتدریج کاهش یافته به طوریکه در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داده و در نهایت در طی ۲۴ ساعت بیان آن افزایش یافت. (Chen et al., 2010) افزایش بیان این ژن را در ۳ ساعت و کاهش آن را در ۲۴ ساعت در ریشه کلزا رقم Zhongyou 821 نشان دادند. نتایج نشان داد که ژن کدکننده اکسین در کوتیلدون بیان شده، اما mRNA آن در سطح نسبتا پائینی در سایر بافتها مشاهده گردید. همچنین ژن پاسخدهی به اکسین به طور اختصاصی در ساقهها بیان شد. آنها مشاهده کردند که ژن کدکننده پروتئین مهار شده توسط اکسین (auxin repressed protein)، ۱۲ ساعت پس از شروع تیمار با مانیتول به بالاترین سطح بیان خود رسید (Chen et al., 2010).
بعضی از ژنهای کدکنندهی پروتئینهای حساس به اکسین بهعنوان ژنهایی شناخته شده اند که نسبت به خشکی تنظیم پایینی دارند، این پیشنهاد می کند که اکسین ممکن است سیگنالینگ تنش خشکی را بطور منفی تنظیم کند. دیگر ژنهای کدکنندهی پروتئینهای حساس به اکسین توسط تنش خشکی القا میشوند et al., ۲۰۱۰) Chen ).
شناسایی ژنهای مرتبط با این تنشها و آنالیز الگوی بیانی آنها، به ما در بهبود تحمل محصولات به تنش با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک کمک خواهد کرد.
۴-۲ بررسیهای انجام شده در سطح فیزیولوژیکی
تنشهای محیطی محدودکننده فتوسنتز از جمله خشکی، میتوانند آسیب سلولی ناشی از اکسیژن را با توجه به تولید ROS افزایش دهند (Mittler, 2002). ROS بسیار واکنشپذیر بوده و در شرایطی که هیچ مکانیسم حفاظتی وجود نداشته باشد، می توانند متابولیسم را از طریق میانکنش با لیپیدها، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک (DNA و RNA) به شدت مختل کرده (Rute and Shao, 2001) و صدمات جبران ناپذیری را به آنزیمها، غشاها و کروموزومها وارد آورند. گیاهان برای محافظت از سلول و سیستمهای subcellular خود از اثرات ناشی از این رادیکالهای اکسیژن فعال مکانیسمهایی را در خود پرورش دادهاند که از آنجمله میتوان به استفاده از آنزیمهایی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، پلیفنل اکسیداز و غیرآنزیمی آسکوربات و گلوتاتیون اشاره نمود (Agarwal and Pandey, 2001). درجه آسیب رسانی ROS بستگی به تعادل بین تولید محصولات ROS و حذف آن توسط این سیستم مهار آنتیاکسیدان دارد Demiral and Turkan, 2005) .(Khan and Panda, 2005; پراکسیدازها متعلق به خانواده بزرگ آنزیمها میباشند که در تمام موجودات یافت میشوند، این پروتئینها دارای گروه پروستتیک فری پروتوپورفیرین XI میباشند. این آنزیمها از چندین سوبسترا برای اکسیداسیون پراکسیدهیدروژن استفاده می کنند. پراکسیدازها به میزان زیاد در گیاهان وجود دارند. که در جاروب کردن پراکسید هیدروژن نقش دارند. آنها در ارتباط با دیواره سلولی میباشند وترکیبات فنوکسی را از اسیدهای سینامیک تولید می کنند. آنزیم GPX یکی از مهمترین پراکسیدازها میباشد (Asada, ۱۹۹۲). آنزیم گایاکول پراکسیداز از آنزیمهایی است که پراکسید هیدروژن تولید شده طی تنشهای اکسیداتیو را از طریق گلوتاتیون احیایی کاهش میدهد .(Bolkhina et al., ۲۰۰۳)
در مطالعه حاضر، افزایش فعالیت GPX (گایاکول پراکسیداز) در ریشه و اندام هوایی رقم زرفام (مقاوم به خشکی) تحت تنش خشکی بسیار قابل توجه بوده اما در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، فعالیت GPX در ریشه کاهش و در اندام هوایی افزایش یافته است. تحت تنش آهسته و/ یا ملایم خشکی، بسیاری از گونه های گیاهی افزایش در فعالیت آنزیم های آنتیاکسیدانت نظیر GPX و SOD را از خود نشان می دهند (Liong, 2003).
(Bandurska, 2002) ، گزارش داد که دو ژنوتیپ جو تحت تنش اسمزی تغییرات مشابهی را در فعالیت گایاکول پراکسیداز نشان می دهند. مقایسه نتایج میزان فعالیت GPX تحت تیمار خشکی، افزایش قابل توجه این پارامترها را بخوبی نشان میدهد که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت دارند. برخی از پژوهشگران فعالیت گایاکول پراکسیداز را اندازه گیری کرده و طی کمبود آب هیچ افزایش یا کاهشی را مشاهده نکردند (Smirnoff, 1993). افزایش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برای مقابله با تنش احتمالی اکسیداتیو حاصل از اعمال تنش خشکی میباشد. به نظر میرسد در مواردی که آسیب تنش به سیستمهای آنزیمی و آنتیاکسیدانی گیاه بسیار بالاست، این سیستمها قادر به واکنش مناسب نبوده، فعالیت آنها کاهش مییابد. همچنین کاهش در فعالیت آنزیمهاى آنتىاکسیدان ممکن است به علت اختلال مولکولهاى آنزیم توسط اکسیژنهاى فعال (ROS) باشد.
یکی از آنزیم های سیستم پاداکسایشی APX (آسکوربات پراکسیداز) میباشد که باعث تبدیل پراکسیدهیدروژن به آب میگردد. این آنزیم از AA (اسید آسکوربیک) به عنوان دهنده الکترون در اولین مرحله چرخهی گلوتاتیون- آسکوربات استفاده می کند، در این چرخه APX دو مولکول AA را به عنوان دهنده مصرف می کند تا پراکسید هیدروژرن را به آب تبدیل کند. ایزوآنزیمهای APX در چهار زیر واحد سلولی حضور دارند:
۱- APXs که در استروما یافت می شود.۲- APXt در تیلاکوئید کلروپلاستها (متصل به غشای) یافت می شود. ۳ – APXm در میکروبادی پراکسیزومها و گلی اکسیزومها (متصل به غشا) یافت می شود. ۴-APXc در سیتوزول یافت می شود. ۵- APXmit در میتوکندریها (متصل به غشای) یافت می شود.
ایزوآنزیمهای APX به ویژه نوع کلروپلاستی و میتوکندریایی به طور اختصاصی از AA به عنوان دهنده الکترون استفاده می کنند (et al., ۲۰۰۲ Shigeru).
در مطالعه حاضر، افزایش فعالیت APX (آسکوربات پراکسیداز) در ریشه و اندام هوایی هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) تحت تنش خشکی بسیار قابل توجه بوده، که میزان آن در اندام هوایی بیشتر میباشد.
میزان پراکسیدهیدروژن بعد از قرارگیری گیاه تحت تأثیر تنش افزایش مییابد، بسیاری ازمحققین معتقدند یک ارتباط نزدیک بین میزان پراکسیدهیدروژن و الگوی MAP کیناز در گیاهان وجود دارد. علاوه بر این مشاهداتی در مورد نقش پراکسیدهیدروژن به عنوان یک سیگنال گزارش شده است. در گیاه برنج مشاهده شده است که افزایش پراکسیدهیدروژن تحت شرایط تنش باعث افزایش بیان ژنهای APX شده است. در گیاه آرابیدوپسیس افزایش پراکسیدهیدروژن تحت تأثیر نور زیاد سبب تغییراتی در انتقال الکترون در پلاستوکینون می شود و احتمالا این تغییر سبب القا APX2 و دیگر خانوادهی ژنی cAPX می شود (et al., ۲۰۰۲ Shigeru). پیشنهاد کرده اند که پراکسیدهیدروژن به عنوان یک پیامبر ثانویه سبب افزایش بیان ژنهای سیستم آنزیمی پاداکسایشی می شود (Foyer and Halliwell, 1976). افزایش فعالیت آنزیم APX تحت تأثیر اشعهیUV در کلزا مشاهده شده است (et al., ۱۹۹۴ Somner). افزایش میزان فعالیت APX در دو واریته حساس (Trihybrid 321) و مقاوم (Giza 2) ذرت تحت تنش خشکی توسط (Moussa and Abdel-Aziz, 2008) نیز گزارش شده است.
CAT (کاتالاز) اولین آنزیم پاداکساینده (ضد اکسایشی) بوده که کشف شده است. آنزیم های CAT به صورت هموتترامریک هستند و باعث تجزیهی پراکسیدهیدروژن به آب و اکسیژن میشوند.CAT ها به طور عمده در سیتوزول، میتوکندری و پراکسیزومها یافت میشوند. به طور کلی CATها در سه کلاس طبقه بندی میشوند. کلاس I : که به مقدار زیادی در برگها بیان شده و وابسته به نور میباشند و پراکسیدهیدروژن را در طول تنفس نوری حذف می کنند. کلاس II : که به طور عمده در بافتهای آوندی یافت میشوند. کلاسIII : به طور غالب در گلیاکسیزومهای دانهها و دانهرستهای جوان یافت میشوند (Dat et al., ۲۰۰۰).
نتایج حاصل از این پزوهش، حاکی از آن است که میزان فعالیت این آنزیم در ریشه هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش یافته، اما در اندام هوایی رقم اکاپی کاهش جزئی و در اندام هوایی رقم زرفام افزایش نشان داده است. در گیاهان آرابیدوپسیس جهش یافتهvtc1 که فعالیت آنزیم CAT دچار نقص میباشد، مشاهده شد که زمانی که این گیاهان تحت تأثیر اشعهیUV قرار گرفتند پراکسیزوم سلولها به علت افزایش بسیار زیاد پراکسیداسیون لیپیدها تخریب شدند (Gao and Zhang, 2008). افزایش میزان فعالیت CAT در دو واریته حساس (Trihybrid 321) و مقاوم (Giza 2) ذرت تحت تنش خشکی توسط (Moussa and Abdel-Aziz, 2008) نیز گزارش شده است. نتایج بدست آمده در این مطالعه، با نتایج محققین فوق همخوانی دارند. افزایش سنتز آنزیم کاتالاز تحت شرایط تنش خشکی نیز گزارش شده است (Dat et al., ۲۰۰۰) .
تنش آبی و UV-B محصولدهی گیاهان را با ممانعت از رشد وفتوسنتز کاهش می دهند. کمبود آب، موجب بستهشدن روزنه شده و بنابراین غلظت CO2 بینسلولی کاهش مییابد. این در حالی است که هیدراسیون سلولهای مزوفیل به دستگاه فتوسنتزی صدمه میرساند . تحت شرایطی که فتوسنتز دچار نقص شده وکلروپلاستها در معرض افزایش انرژی بر انگیختگی قرار دارند، کاهش نوری اکسیژن وجود دارد که منتج به تولید پیوسته گونه اکسیژن فعال (ROS) می شود که عبارتند از هیدروژنپراکسید، آنیونسوپراکسید و رادیکالهای هیدروکسیل (and Inzé, ۱۹۹۵ Van Montagu) که به غشا و آنزیمها صدمه میزنند. بنابراین افزایش محصول رادیکالهای اکسیژن در پراکسیداسیون لپیدهای غشا نقش بسزایی دارند (Durães et al., ۱۹۹۴). مالوندیآلدهید محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع در فسفولیپیدها بوده است که به عنوان شاخص آسیب رادیکالهای آزاد به غشای سلولی تحت شرایط تنش استفاده می شود (Shakirova, 2007). این ترکیب در نتیجه پراکسیداسیون چربیهای غیر اشباع به ویژه لینولئیک اسید تولید می شود. در واقع رادیکالهای هیدروکسیل و اکسیژن منفرد میتوانند با گروه های متیلن واکنش داده و باعث تشکیل گروه های دی- ان (Dienes) رادیکالهای لیپید پراکسی و هیدروپراکسیدها شوند، این رادیکالها نیز با جذب هیدروژن از اسیدهای چرب غیر اشباع باعث واکنش زنجیروار پراکسیداسیون میشوند (Smirnoff, ۱۹۹۵). نتایج حاصل از این پزوهش، حاکی از آن است که میزانMDA در ریشه رقم زرفام (مقاوم به خشکی) کاهش و در ریشه رقم اکاپی (حساس به خشکی) افزایش یافته، اما در اندام هوایی رقم اکاپی میزانMDA کاهش و در اندام هوایی رقم زرفام افزایش نشان داده است. بر اساس نتایج (Tatar et al., ۲۰۰۸) ، خشکی موجب افزایش سطح MDA در گیاهان گندم (Triticum aestivum L.) گشته که در چهاردهمین روز تنش به بالاترین سطح خود میرسد. علاوه بر این، افزایش سطح MDA تحت تنش خشکی در گیاهان زیتون نیز مشاهده شده است (Bacelar et al., ۲۰۰۷). برگهایی از گیاه گوجه فرنگی که تحت تنش خشکی قرار گرفتند، افزایش در پراکسیداسیون لیپیدی را نشان دادند Nasibi, 2011)). با بررسی واکنش سه رقم برنج به تنش شوری دریافتند که تنش شوری سبب تخریب غشاهای سلولی و افزایش تولید مالوندیآلدهید شد، که میزان تولید مالوندیآلدهید در رقم حساس به شوری بسیار بیشتر از رقم مقاوم به شوری بود Bhattacharjee and Mukherjee, 2002)). (Feng et al., ۲۰۰۷)، نشان دادند که میزان MDA تحت تنش UV-B و خشکی افزایش مییابد که در این بین UV-B اثر بیشتری بر این پارامتر نسبت به تنش همزمان و خشکی دارد. علاوه بر این ، کاهش در مقدار MDA تحت تنش همزمان در مقایسه با اثر هر یک از تنشها بطور جداگانه در سویا (Glycin max L.) به اثبات رسیده استAmal et al., ۲۰۱۰) ).
مشخص شده است که تنش آبی منجر به برخی تغییرات در محتوای کربوهیدراتها و پروتئینها می شود. در برگ گیاهان تحت تنش آبی عموما قند محلول انباشته می شود ، درحالیکه، نشاسته و پروتئین نسبت به شاهد به مقدار کمی کاهش مییابند. این ترکیبات osmoprotectants نقش مهمی در تنظیم اسمزی و حفاظت اسمزی بازی می کنند (Godallah et al., ۱۹۹۹ Jones and Hammond–Kosack, 2001;). از جمله مکانیسمهایی که گیاهان در مقابله با تنش بکار میگیرند سنتز پروتئینهاست. میزان پروتئین محلول یکی از شاخصههای مهم وضعیت فیزیولوژی در گیاهان میباشد. تغییرات هیدراسیون پروتئین یکی از نتایج میزان یون بالا در تنش اسمزی در سلولهای گیاهی محسوب می شود (Parvaiz and Satyavati, 2008). برخى از پژوهشگران رکود سنتز پروتئین را به کاهش تعداد پلىزومهاى سلولى نسبت دادهاند Creelman et al., ۱۹۹۰)). نتایج حاصل از این مطالعه، بیانگر آن است که میزان پروتئین کل در کل Seedling در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش نشان داده است. علت افزایش پروتئین ممکن است به این دلیل باشد که تنش باعث تحریک افزایش پروتئینهای موجود گردیده و یا پروتئینهای جدیدی سنتز شده باشند (.(Abolhasani Zeraatkar et al., ۲۰۱۰ محتوای پروتئین محلول در گیاه angustifolius Lupinus در معرض تنش خشکی و شوری تحت ﺗﺄثیر قرار نگرفت و محتوای پروتئین در ریشه و برگهای جوان و قدیمی آفتابگردان (annuus Helianthus) و blumei Coleus کاهش نشان داد (Dos Santos et al., ۱۹۹۹ ؛Gilbert et al., ۱۹۸۹). گزارش کردند که کل پروتئین محلول به میزان قابل توجهی در لوبیا (Phaseolus vulgaris) حساس به شوری کاهش مییابد، اما درگیاهان P.acutifolius متحمل به شوری افزایش مییابد۲۰۰۴) .(Yurekli et al., این نتایج مختلف در تنش شوری نشان داد که پاسخ به تنش شوری بستگی به گونه های گیاهی و حتی در ارقام همان گونه گیاهی، مرحله رشد گیاه، طول مدت و میزان کاربرد نمک دارد (Parvaiz and Satyavati, 2008).
Agarwal and shaheen, 2007))، دریافتند که کاهش در غلظت پروتئین می تواند علامت نوعی از تنش اکسیداتیو بوده و در گیاهان تحت تنش خشکی مشاهده می شود. پروتئینهای محلول بطور قابل توجهی با سن گیاه ارتباط داشته و تحت تنش آبی در مقایسه با شاهد افزایش مییابد. نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج (nasibi and kalantary, 2005)، در گیاه کلزا (Brassica napus) همخوانی دارد.
تنش خشکی بر متابولیسم قندها در گیاهان تأثیر می گذارد. قندها به صورتهای گوناگون در بردباری به خشکی در گیاهان شرکت می کنند. قندها میتوانند به عنوان متابولیتهای سازگار یا اسمولیتها سبب تنظیم اسمزی شوند. همچنین سبب پایداری غشا و پروتئینهای در حال خشکشدن میگردند، بدین صورت که تثبیت غشاء از طریق جایگزین شدن آب موجود در غشای لیپیدی دو لایه صورت میگیرد و به این ترتیب از متراکم شدن فسفولیپیدها جلوگیری کرده و همچنین از پیوندهای نابجا بین پروتئینهای غشایی جلوگیری می کنند. پایدارسازی پروتئینها نیز از طریق تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین گروه های کربوکسیل قند و زنجیرههای قطبی پروتئین صورت میگیرد .(Ingram and Bartles, 1996)
تجمع قند محلول در سلول گیاهی تحت تنش شوری یا خشکی، پاسخ شایعی میباشد. این ترکیب osmoprotectant نقش مهمی در تنظیم اسمزی و حفاظت اسمزی بازی می کنند (Jones and Hammond–Kosack, 2001).
نتایج حاصل از این پژوهش، بیانگر آن است که میزان قند محلول در کل Seedling در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش نشان داده است. تجمع بیش از حد قند در بسیاری از گونه های گیاهی در معرض شوری، خشکی و UV-B گزارش شده است (Ranjbarfordoei et al., ۲۰۰۹ Musil et al., ۲۰۰۲;). قندهای محلول ممکن است به عنوان یک osmoprotectant، در برقراری ثبات در غشاء سلولی و حفظ فشار تورگر عمل نمایند.
۴-۳ نتیجه گیری کلی
سیگنالینگ تنش غیرزیستی باتوجه به افزایش در بهرهوری گیاهان بخش مهمی را تشکیل میدهد. بنابراین درک بنیادی مکانیسمهای زیربنایی عملکرد ژنهای تنش، برای توسعه گیاهان تراریخت با اهمیت است. با توجه به نتایج بدست آمده از طریق بررسیهای مولکولی روی دو رقم حساس و مقاوم کلزا در این پژوهش، امید است این مطالعات، اصول استراتژی های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش، به ما ارائه کنند. نتایج انجام یافته در سطح مولکولی بیانگر رابطه سطوح فیزیولوژیک و مولکولی با یکدیگر میباشند. میزان پراکسیدهیدروژن بعد از قرارگیری گیاه تحت تأثیر تنش افزایش مییابد، بسیاری ازمحققین معتقدند یک ارتباط نزدیک بین میزان پراکسیدهیدروژن و الگوی MAP کیناز در گیاهان وجود دارد. علاوه بر این مشاهداتی در مورد نقش پراکسیدهیدروژن به عنوان یک سیگنال گزارش شده است. همچنین پیشنهاد کرده اند که پراکسیدهیدروژن به عنوان یک پیامبر ثانویه سبب افزایش بیان ژنهای سیستم آنزیمی پاداکسایشی می شود. کمبود آب، موجب بسته شدن روزنه شده و بنابراین غلظت CO2 بین سلولی کاهش مییابد. این در حالی است که هیدراسیون سلولهای مزوفیل به دستگاه فتوسنتزی صدمه میرساند . تحت شرایطی که فتوسنتز دچار نقص شده وکلروپلاستها در معرض افزایش انرژی بر انگیختگی قرار دارند، کاهش نوری اکسیژن وجود دارد که منتج به تولید پیوسته گونه اکسیژن فعال (ROS) می شود که به غشا و آنزیمها صدمه میزنند. بنابراین افزایش محصول رادیکالهای اکسیژن در پراکسیداسیون لپیدهای غشا نقش بسزایی دارند. تغییرات ایجاد شده مانند افزایش در میزان فعالیت آنزیم های آنتیاکسیدان، افزایش در متابولیتهایی مانند پروتئینها و قندها میتوانند راهکارهای دفاعی بسیار مهمی برای کاهش میزان اثرات تخریبی ناشی از تنش خشکی در گیاه کلزا باشند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که رقم اکاپی (حساس به خشکی) نسبت به تنش خشکی، حساسیت بالایی داشته، و رقم زرفام (مقاوم به خشکی) نسبت به این تنش حساسیت پائینی دارد. بنابراین، رقم زرفام بهعنوان رقم متحمل به خشکی شناخته می شود.
۴-۴ پیشنهادات
۱- مطالعه نقش این ژنها در جزئیات، درک بیشتری از مکانیسم مولکولی کلزا در پاسخ به تنش خشکی خواهد داد و همچنین اصول استراتژی های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش به ما ارائه خواهد داد.
۲- بررسی تعداد ژنهای بیشتر و سایر ژنهای درگیر در مسیر Signal transduction .
۳- استفاده از Real- Time PCR برای مطالعه بیان ژنها.
۴- مطالعه بیان ژنها با بهره گرفتن از تکنولوژی DNA Microarray..
۵- مطالعه بیان این ژنها تحت تنشهای زیستی از قبیل ویروسها و قارچها.
۶- تولید گیاهان تراریخت کلزا متحمل به تنش خشکی با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک.
۷- - باتوجه به اهمیت آنتیاکسیدانها در حفاظت گیاه در مقابل تنش خشکی، پیشنهاد می شود که مطالعات آنتیاکسیدانها از نظر کیفی توسط روشها و دستگاههای کارآمد بیشتر مورد ارزیابی قرار گیرند.
۵- ضمائم
