نمودار ۳-۱۵: تغییرات میزان MDAدر اندام هوایی گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE می­باشد. اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام به­تنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
۳-۲-۵ بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا
نتایج حاصل از اثر تنش مذکور بر میزان پروتئین کل در گیاه کلزا در نمودار (۳-۱۶) به ثبت رسیده است. این آزمایش بر روی کل گیاهچه (Seedlings) انجام گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش این پارامتر در گیاه کلزا ارقام اکاپی (حساس به خشکی) و زرفام (مقاوم به خشکی) طی تنش خشکی با مانیتول ۲۰۰ میلی مولار می­باشد. . به­ طوری­که در رقم زرفام در طی ۳ ساعت بیشترین و در رقم اکاپی در طی ۱۲ ساعت بیشترین مقدار پروتئین مشاهده گردید.
نمودار (۳-۱۶): تغییرات میزان پروتئین کل در گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE می­باشد.
اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام به­تنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
۳-۲-۶ بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا
نتایج حاصل از بررسی میزان قندهای محلول در نمودار­ (۳-۱۷) منعکس شده است. این آزمایش بر روی کل گیاهچه (Seedlings) انجام گرفت. در بررسی­های انجام یافته مشخص شد که میزان قندهای محلول عموما تحت تنش خشکی با مانیتول ۲۰۰ میلی مولار در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) بالا رفته، به­ طوری­که این افزایش در رقم اکاپی بیشتر مشهود بود. در رقم زرفام میزان این پارامتر به­تدریج افزایش یافته که در طی ۱۲ ساعت به بیشترین مقدار خود رسیده و همچنین در رقم اکاپی در طی ۱۲ ساعت بیشترین میزان قندهای محلول مشاهده گردید.
نمودار (۳-۱۷): تغییرات میزان قندهای محلول در گیاه کلزا ارقام Zarfam و Okapi تحت تنش خشکی. بارها نشانگر ± SE می­باشد. اعداد با حروف لاتین متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار در بین تیمارهای هر کدام از ارقام به­تنهایی هستند .(P˂۰.۰۵)
فصل چهارم:
بحث و بررسی
۴-۱- بررسی‌های انجام شده در سطح مولکولی
پروتئین­کیناز آنزیمی است که با افزودن گروه فسفات (فسفوریلاسیون) به پروتئین‌ها در آنها تغییر ایجاد می‌کند. معمولاً فسفوریلاسیون با تغییر فعالیت آنزیمی، موقعیت سلول و یا همکاری با دیگر پروتئین‌ها باعث تغییر در عملکرد پروتئین هدف (سوبسترا) می‌گردد. ژنوم انسان حدوداً دارای ۵۰۰ ژن پروتئین­کیناز است. پروتئین­کینازها همچنین در باکتری‌ها و گیاهان نیز یافت شده‌اند (Manning and Whyte, 2002). ژن پروتئین­کیناز(Protein Kinase) نقش قابل توجهی را در شرایط استرس به ویژه در گیاهانی مانند مدل گیاهی آرابیدوپسیس، تنباکو و برنج ایفا می­ کند. این ژن در تنظیم جنبه­ های کلیدی اعمال سلولی از جمله تقسیم سلولی، متابولیسم و پاسخ به محرک­های خارجی دخالت داردHrabak, 2000) ). آنالیز مقایسه­ ای B.napus با آرابیدوپسیس نه تنها به­خاطر درک شباهت ژنومیکی در بین دو گونه، بلکه نیز به­ دلیل کشف ژن­های مهم برای مهندسی ژنتیک B.napus کاملا سودمند می­باشد. نتایج نشان داده است که شباهت قابل توجهی بین دو ژنوم در پاسخ به تنش­های غیر­زیستی وجود دارد. ژن­هایی مانند پروتئین­کیناز در B.napus که در پاسخ به تنش­های غیر­زیستی عمل می­ کنند مشابه با ژن پروتئین­کیناز موجود در آرابیدوپسیس تنظیم بالایی دارند et al., ۲۰۱۰) Chen ). ژن پروتئین­کیناز توسط تنش­های خشکی، شوری و ABA القاء شده که پیشنهاد می­ کند این ژن نقش مهمی در مسیر Signal transduction در ارتباط با تنش­های غیر­زیستی و ABA در B.napus بازی می­ کندet al., ۲۰۱۰) Chen ).

بر اساس نتایج حاصل از این مطالعه، در گیاهچه­های (Seedlings) 8 روزه­ی کلزا رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن پروتئین­کیناز(PK) نسبت به کنترل (زمان صفر) به­ طور معنی­داری افزایش یافته، به­ طوری­که بیشترین میزان بیان را در ۱۲ ساعت و کمترین بیان را در ۳ ساعت نشان داد. اما در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن PK نسبت به زمان کنترل کاهش معنی­داری داشته و در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد.
Chen و همکاران ( (۲۰۱۰با بررسی روی کلزا رقم Zhongyou 821 بیشترین میزان بیان این ژن را طی ۲۴ ساعت در ریشه کلزا نشان دادند. آنها مشاهده نمودند که این ژن در بافت گل در بالاترین سطح، اما در سایر بافت­ها در سطح متوسط یا پائینی بیان شده است. به طوری­که بعد از گل­ها در ساقه بیشترین بیان را داشته، در ریشه به مقدار کمی بیان شده و در برگ اصلا بیان نمی شود. آنها همچنین دریافتند که این ژن تحت تنش­ شوری با NaCl 150 میلی مولار و تنش ABA 100 میکرو مولار، ۶ ساعت بعد از شروع تیمار بیشترین بیان را نشان داده است. نتایج جالبی از این پژوهش بدست آمده است که نشان­دهنده ارتباط معنی­دار بین بیان ژن در دو رقم حساس و مقاوم به خشکی می­باشد. همان­طوری­که در بالا ذکر شد بیشترین بیان در ۱۲ ساعت در رقم اکاپی با کمترین بیان در ۱۲ ساعت در رقم زرفام همراه می­باشد. این پیشنهاد می­ کند که ژن PK در رقم مقاوم زرفام به­ طور منفی و در رقم حساس اکاپی به­ طور مثبت تنظیم می­ شود.
گیاهان اغلب در طول رشد ­و ­نمو خود تحت تاثیر تنش­های مختلفی قرار گرفته و ژن­های دفاعی آنها در فرایند پاسخ به تنش درگیر هستند. فسفریلاسیون/دفسفریلاسیون پروتئین یک مکانیسم تنظیم­کنندگی در کنترل فعالیت این ژن­های دفاعی است. آبشار پروتئین­کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مهم­ترین مسیرهای فسفریلاسیون بوده که در پائین­دست سنسورها/ رسپتورها عمل می­ کند و پاسخ­های سلولی را نسبت به محرک­های داخلی و خارجی تنظیم می­ کند al., ۲۰۰۷) .(Wang et آبشار MAPK دارای سه­جزء سیگنالینگ کینازی بوده که به­ طور فراوانی در بین یوکاریوت­ها محافظت شده و واسطه­های مهمی در مسیر Signal transduction در سلول­ها هستند. مطالعات زیادی اثبات کرده ­اند که MAPK­ها نقش مهمی در تنظیم پاسخ به تنش و نمو گیاه بازی کرده و می­توانند توسط انواعی از تنش­های زیستی و غیر­زیستی، از جمله خشکی، شوری، سرما، پاتوژن­ها و ABA فعال شوندet al., ۲۰۱۰) Chen). ­MAPKهای یوکاریوتی در پائین­دست MAPK کینازها (MAPKK) و MAPKK کینازها (MAPKKK) در آبشارهای معکوس فسفریلاسیون برای تبدیل سیگنال­های خارج سلولی به پاسخ­های سلولی عمل می­ کنند. در حالی­که این رویدادها سیگنال­های ویژه­ای را تقویت کرده، آنها­ همچنین سیگنال­های مختلف را به­واسطه­ Cross-talk از طریق کمپلکس­های خیلی منظم یکپارچه می­ کنند. بسیاری از سوبستراهای مهم برای MAPK­ها فاکتورهای نسخه­برداری بوده که بیان ژن­های پائین­دست را کنترل می­ کنند (Petersen .(et al., ۲۰۰۰ موتانت خنثی MAP4K (Atmpk4) آرابیدوپسیس عمدتا پاسخ­های دفاعی با واسطه­ -SA را بیان کرده و مقاومت افزایش یافته­ای را نسبت به پاتوژن­های بدخیم نشان می­دهد، اما نمی­تواند بیان ژن­های نشانگر دفاعی در مسیرهای JA/ET را القاء کرده و سبب افزایش حساسیت نسبت به پاتوژن نکروتروفیک A.brassicicola شود. در توتون، MPK4 (NtMPK4) در سیگنالینگ JA و پاسخ به ازن و همچنین حمله علف­خواری دخیل می­باشد. برعکس MPK4، برخی از MAPK­ها نقش مثبتی را در تنظیم پاسخ­های دفاعی بیماری وابسته به پاسخ­های حساسیت بالا (HR) و مقاومت اکتسابی سیستمیک SAR)) بازی می­ کنند .(Wang et al., ۲۰۰۹) تاکنون تحت تیمار با تنش­های غیرزیستی، مطالعه­ ای روی ژن MAPK4 صورت نگرفته است. در این مطالعه، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن MAPK4 نسبت به کنترل (زمان صفر) به­ طور معنی­داری افزایش یافته، به­ طوری­که بیان آن با گذشت زمان افزایش یافته و ماکزیمم بیان آن ۱۲ ساعت پس از شروع تیمار بوده و کمترین بیان را بعد از کنترل در ۳ ساعت نشان داد. ولی در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن MAPK4 نسبت به زمان کنترل کاهش معنی­داری داشته و در طی ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داد. جالب است که AtMPK4 به­­طور منفی توسط تنش­های زیستی و به­ طور مثبت توسط تنش­های غیرزیستی تنظیم می­شوند (Yu et al., ۲۰۰۵). پاسخ MPK4 به هورمون­های گیاهی اکسین، سیتوکینین، براسینواستروئید، جیبرلین و آبسیزیک اسید مشاهده نشده است .(Petersen et al., ۲۰۰۰) مشاهده کرده ­اند که بیان BnMPK4 در پاسخ به قارچ Sclerotinia sclerotiorum در رقم مقاوم Zhongshuang9 تنظیم بالایی و در رقم ۸۴۰۳۹ (حساس به قارچ) بعد از گذشت ۶ ساعت از شروع مایه کوبی تنظیم پائینی نشان داد .(Wang et al., ۲۰۰۹) نتایج بدست آمده در این پژوهش حاکی از آن است که سطح بیان ژن MPK4 در دو رقم اکاپی و زرفام متفاوت بوده و پیشنهاد می­ کند که خواص تنظیم­کنندگی این ژن در دو رقم عکس هم می­باشند.
تحت تنش­های محیطی، گیاهان شبکه ­های سیگنالی پیچیده­ای را برای درک سیگنال­های مجیطی و سازگاری به شرایط نامطلوب توسعه داده­اند. پژوهش­های اخیر در مخمر، پستانداران و گیاهان، نشان داده­اند که مسیرهای سیگنالی MAPK یکی از مهم­ترین و حفاظت­شده­ترین روش­ها برای کنترل پاسخ­های سلولی و رشد می­باشند. چندین MAPK از قبیل AtMPK3، AtMPK4 و AtMPK6 توسط تنش­های زیستی و غیرزیستی فعال می­شوند. پروتئین BnMPK3 ترکیبی از ۳۷۱ اسید آمینه بوده که همولوژی بالایی با AtMPK3 (۹۴ درصد تشابه) و MmERK2 (۵۶/۵۰ درصد) دارد. مشابه با AtMPK3 و سایر پروتئین­کیناز­های فعال شده با میتوژن، BnMPK3 شامل یک موتیف آمینو­اسیدی حفاظت شده T196XY198 (X هر نوع آمینو­اسیدی می ­تواند باشد) بوده، که توسط MAPK­ها و دمین CD (دمین اتصالی مشترک)، که در ناحیه C- ترمینال خود، که به­عنوان مکان اتصالی برای MAPK ها عمل می­ کند، فسفریله می­ شود.
بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژنMAPK3 به­ طور معنی­داری افزایش یافته، به­ طوری­که بیشترین میزان بیان در طی ۲۴ ساعت مشاهده گردید. همچنین در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژنMAPK3 نسبت به زمان کنترل افزایش معنی­داری داشته و در طی ۳ ساعت بیشترین سطح بیان را نشان داد. در مطالعه(Yu et al., ۲۰۰۵) پاسخ BnMPK3 به مانیتول ۲۰۰ میلی مولار، ۵ دقیقه بعد از اعمال تیمار شروع شده و سپس به اوج رسید، اما به نظر رسید که منحنی بیان آن در نوسان بوده و به­ طور واضحی پس از ۶ ساعت کاهش یافت. پاسخ BnMPK3 به Nacl ۱۰۰ میلی مولار پس از طی ۲ دقیقه شروع شده و بعد از ۱ ساعت به بالاترین سطح رسیده و پس از ۲۴ ساعت کاهش پیدا کرد. آنها همچنین دریافتند که بیان BnMPK3 توسط SA (سالیسیلیک اسید) و m-JA (متیل ژاسمونات) تنظیم بالایی نشان داده، که معمولا در عرض ۲۰ دقیقه پس از اعمال تیمار افزایش یافت، به­ ویژه m-JA که به­ طور مداوم بیان آن افزایش نشان داد. (Yu et al., ۲۰۰۵) برای درک عملکرد BnMPK3 تحت تنش­های مختلف، BnMPK3 را به درون سویه­ای از مخمر انتقال (Transform) کرده و برای بررسی بیان بالای BnMPK3 در مخمر، از تیمار داروی پراکسیداسیون چربی tBuooH و تیمار اسمزی مانیتول استفاده گردید که در نتیجه در مخمر­های تراریخت نسبت به سلول­های کنترل تحمل به مانیتول و tBuooH به­ ویژه در هنگام اعمال غلظت بالای مانیتول (۶۰۰ میلی مولار) بیشتر مشاهده گردید.
تا به امروز چندین ژن از خانواده ژنومی شناسایی شده ­اند که میزان بیان آنها نسبت به اکسین تغییر می­ کند. در بسیاری از موارد، این ژن­ها نه تنها به اکسین بلکه به سایر عوامل القا­کننده نیز پاسخ می­ دهند .(Ogbourne and Antalis, 1998) در سال­های اخیر، پیشرفت­های قابل­توجهی در روشن­ساختن مسیر Signal transduction اکسین صورت گرفته­ است. هم­اکنون شواهد قوی وجود دارد که تنظیم بیان ژن اکسین تحت­تاثیر سایر مسیرهای سیگنالی قرار می­گیرد. این شواهد عمدتا از خصوصیات موتانت­های پاسخ­دهی به اکسین بدست آمده است و نشان می­دهد که سیگنالینگ اکسین به­واسطه تخریب پروتئین از طریق مسیر پروتئازوم / یوبی کوئیتین، فسفریلاسیون پروتئین، نور و سایر هورمون­ها تحت­تاثیر قرار می­گیرد .(Hagen and Guilfoyle, 2002)
در این مطالعه، در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، بیان ژن Auxin responsive protein نسبت به کنترل (زمان صفر) به­ طور معنی­داری افزایش یافت. پس از شروع تیمار، بیان این ژن به­تدریج بالا رفته به­ طوری­که بیشترین میزان بیان را در ۲۴ ساعت نشان داد. با این حال در رقم زرفام (مقاوم به خشکی)، بیان ژن Auxin responsive protein پس از شروع تیمار، به­تدریج کاهش یافته به­ طوری­که در ۱۲ ساعت کمترین بیان را نشان داده و در نهایت در طی ۲۴ ساعت بیان آن افزایش یافت. (Chen et al., 2010) افزایش بیان این ژن را در ۳ ساعت و کاهش آن را در ۲۴ ساعت در ریشه­ کلزا رقم Zhongyou 821 نشان دادند. نتایج نشان داد که ژن کد­کننده اکسین در کوتیلدون بیان شده، اما mRNA آن در سطح نسبتا پائینی در سایر بافت­ها مشاهده گردید. همچنین ژن پاسخ­دهی به اکسین به­ طور اختصاصی در ساقه­ها بیان شد. آنها مشاهده کردند که ژن کد­کننده­ پروتئین مهار شده توسط اکسین (auxin repressed protein)، ۱۲ ساعت پس از شروع تیمار با مانیتول به بالاترین سطح بیان خود رسید (Chen et al., 2010).
بعضی از ژن­های کدکننده­ی پروتئین­های حساس به اکسین به­عنوان ژن­هایی شناخته شده ­اند که نسبت به خشکی تنظیم پایینی دارند، این پیشنهاد می­ کند که اکسین ممکن است سیگنالینگ تنش خشکی را بطور منفی تنظیم کند. دیگر ژن­های کدکننده­ی پروتئین­های حساس به اکسین توسط تنش خشکی القا می­شوند et al., ۲۰۱۰) Chen ).
شناسایی ژن­های مرتبط با این تنش­ها و آنالیز الگوی بیانی آنها، به ما در بهبود تحمل محصولات به تنش با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک کمک خواهد کرد.
۴-۲ بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی
تنش­های محیطی محدود­کننده فتوسنتز از جمله خشکی، می­توانند آسیب سلولی ناشی از اکسیژن را با توجه به تولید ROS افزایش دهند (Mittler, 2002). ROS بسیار واکنش­پذیر بوده و در شرایطی که هیچ مکانیسم حفاظتی وجود نداشته باشد، می توانند متابولیسم را از طریق میان­کنش با لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک (DNA و RNA) به شدت مختل کرده (Rute and Shao, 2001) و صدمات جبران­ ناپذیری را به آنزیم­ها، غشا­ها و کروموزوم­ها وارد آورند. گیاهان برای محافظت از سلول و سیستم­های subcellular خود از اثرات ناشی از این رادیکال­های اکسیژن فعال مکانیسم­هایی را در خود پرورش داده­اند که از آن­جمله می­توان به استفاده از آنزیم­هایی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، پراکسیداز، گلوتاتیون ردوکتاز، پلی­فنل اکسیداز و غیر­آنزیمی آسکوربات و گلوتاتیون اشاره نمود (Agarwal and Pandey, 2001). درجه آسیب رسانی ROS بستگی به تعادل بین تولید محصولات ROS و حذف آن توسط این سیستم مهار آنتی­اکسیدان دارد Demiral and Turkan, 2005) .(Khan and Panda, 2005; پراکسیدازها متعلق به خانواده بزرگ آنزیم­ها می­باشند که در تمام موجودات یافت می­شوند، این پروتئین­ها دارای گروه پروستتیک فری پروتوپورفیرین XI می­باشند. این آنزیم­ها از چندین سوبسترا برای اکسیداسیون پراکسید­هیدروژن استفاده می­ کنند. پراکسیدازها به میزان زیاد در گیاهان وجود دارند. که در جاروب کردن پراکسید هیدروژن نقش دارند. آنها در ارتباط با دیواره سلولی می­باشند وترکیبات فنوکسی را از اسید­های سینامیک تولید می­ کنند. آنزیم GPX یکی از مهم­ترین پراکسیداز­ها می­باشد (Asada, ۱۹۹۲). آنزیم گایاکول پراکسیداز از آنزیم­هایی است که پراکسید هیدروژن تولید شده طی تنش­های اکسیداتیو را از طریق گلوتاتیون احیایی کاهش می­دهد .(Bolkhina et al., ۲۰۰۳)
در مطالعه حاضر، افزایش فعالیت GPX (گایاکول پراکسیداز) در ریشه و اندام هوایی رقم زرفام (مقاوم به خشکی) تحت تنش خشکی بسیار قابل توجه بوده اما در رقم اکاپی (حساس به خشکی)، فعالیت GPX در ریشه کاهش و در اندام هوایی افزایش یافته است. تحت تنش آهسته و/ یا ملایم خشکی، بسیاری از گونه­ های گیاهی افزایش در فعالیت آنزیم­ های آنتی­اکسیدانت نظیر GPX و SOD را از خود نشان می­ دهند (Liong, 2003).
(Bandurska, 2002) ، گزارش داد که دو ژنوتیپ جو تحت تنش اسمزی تغییرات مشابهی را در فعالیت گایاکول پراکسیداز نشان می­ دهند. مقایسه نتایج میزان فعالیت GPX تحت تیمار خشکی، افزایش قابل توجه این پارامتر­ها را بخوبی نشان می­دهد که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت دارند. برخی از پژوهشگران فعالیت گایاکول پراکسیداز را اندازه ­گیری کرده و طی کمبود آب هیچ افزایش یا کاهشی را مشاهده نکردند (Smirnoff, 1993). افزایش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز برای مقابله با تنش احتمالی اکسیداتیو حاصل از اعمال تنش خشکی می­باشد. به نظر می­رسد در مواردی که آسیب تنش به سیستم­های آنزیمی و آنتی­اکسیدانی گیاه بسیار بالاست، این سیستم­ها قادر به واکنش مناسب نبوده، فعالیت آنها کاهش می­یابد. همچنین کاهش در فعالیت آنزیم­هاى آنتى­اکسیدان ممکن است به علت اختلال مولکول­هاى آنزیم توسط اکسیژن­هاى فعال (ROS) باشد.
یکی از آنزیم­ های سیستم پاد­اکسایشی APX (آسکوربات پراکسیداز) می­باشد که باعث تبدیل پراکسید­هیدروژن به آب می­گردد. این آنزیم از AA (اسید آسکوربیک) به عنوان دهنده الکترون در اولین مرحله­ چرخه­ی گلوتاتیون- آسکوربات استفاده می­ کند، در این چرخه APX دو مولکول AA را به عنوان دهنده مصرف می­ کند تا پراکسید هیدروژرن را به آب تبدیل کند. ایزوآنزیم­های APX در چهار زیر واحد سلولی حضور دارند:
۱- APXs که در استروما یافت می­ شود.۲- APXt در تیلاکوئید کلروپلاست­ها (متصل به غشای) یافت می­ شود. ۳ – APXm در میکروبادی پراکسیزوم­ها و گلی اکسیزوم­ها (متصل به غشا) یافت می­ شود. ۴-APXc در سیتوزول یافت می­ شود. ۵- APXmit در میتوکندری­ها (متصل به غشای) یافت می­ شود.
ایزوآنزیم­های APX به ویژه نوع کلروپلاستی و میتوکندریایی به طور اختصاصی از AA به عنوان دهنده الکترون استفاده می­ کنند (et al., ۲۰۰۲ Shigeru).
در مطالعه حاضر، افزایش فعالیت APX (آسکوربات پراکسیداز) در ریشه و اندام هوایی هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) تحت تنش خشکی بسیار قابل توجه بوده، که میزان آن در اندام هوایی بیشتر می­باشد.
میزان پراکسید­هیدروژن بعد از قرارگیری گیاه تحت تأثیر تنش افزایش می­یابد، بسیاری ازمحققین معتقدند یک ارتباط نزدیک بین میزان پراکسید­هیدروژن و الگوی MAP کیناز در گیاهان وجود دارد. علاوه بر این مشاهداتی در مورد نقش پراکسید­هیدروژن به عنوان یک سیگنال گزارش شده است. در گیاه برنج مشاهده شده است که افزایش پراکسید­هیدروژن تحت شرایط تنش باعث افزایش بیان ژن­های APX شده است. در گیاه آرابیدوپسیس افزایش پراکسید­هیدروژن تحت تأثیر نور زیاد سبب تغییراتی در انتقال الکترون در پلاستوکینون می­ شود و احتمالا این تغییر سبب القا APX₂ و دیگر خانواده­ی ژنی cAPX می­ شود (et al., ۲۰۰۲ Shigeru). پیشنهاد کرده ­اند که پراکسید­هیدروژن به عنوان یک پیامبر ثانویه سبب افزایش بیان ژن­های سیستم آنزیمی پاد­اکسایشی می­ شود (Foyer and Halliwell, 1976). افزایش فعالیت آنزیم APX تحت تأثیر اشعه­یUV در کلزا مشاهده شده است (et al., ۱۹۹۴ Somner). افزایش میزان فعالیت APX در دو واریته حساس (Trihybrid 321) و مقاوم (Giza 2) ذرت تحت تنش خشکی توسط (Moussa and Abdel-Aziz, 2008) نیز گزارش شده است.
CAT (کاتالاز) اولین آنزیم پاد­­اکساینده (ضد اکسایشی) بوده که کشف شده است. آنزیم­ های CAT به صورت هموتترامریک هستند و باعث تجزیه­­ی پراکسید­هیدروژن به آب و اکسیژن می­شوند.CAT ها به­ طور عمده در سیتوزول، میتوکندری و پراکسی­زوم­ها یافت می­شوند. به طور کلی CAT­ها در سه کلاس طبقه ­بندی می­شوند. کلاس I : که به مقدار زیادی در برگها بیان شده و وابسته به نور می­باشند و پراکسید­هیدروژن را در طول تنفس نوری حذف می­ کنند. کلاس II : که به­ طور عمده در بافت­های آوندی یافت می­شوند. کلاسIII : به­ طور غالب در گلی­اکسی­زوم­ها­ی دانه­ها و دانه­رست­های جوان یافت می­شوند (Dat et al., ۲۰۰۰).
نتایج حاصل از این پزوهش، حاکی از آن است که میزان فعالیت این آنزیم در ریشه­ هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش یافته، اما در اندام هوایی رقم اکاپی کاهش جزئی و در اندام هوایی رقم زرفام افزایش نشان داده است. در گیاهان آرابیدوپسیس جهش یافتهvtc1 که فعالیت آنزیم CAT دچار نقص می­باشد، مشاهده شد که زمانی که این گیاهان تحت تأثیر اشعه­یUV قرار گرفتند پراکسیزوم سلول­ها به علت افزایش بسیار زیاد پراکسیداسیون لیپیدها تخریب شدند (Gao and Zhang, 2008). افزایش میزان فعالیت CAT در دو واریته حساس (Trihybrid 321) و مقاوم (Giza 2) ذرت تحت تنش خشکی توسط (Moussa and Abdel-Aziz, 2008) نیز گزارش شده است. نتایج بدست آمده در این مطالعه، با نتایج محققین فوق هم­خوانی دارند. افزایش سنتز آنزیم کاتالاز تحت شرایط تنش خشکی نیز گزارش شده است (Dat et al., ۲۰۰۰) .
تنش آبی و UV-B محصول­دهی گیاهان را با ممانعت از رشد وفتوسنتز کاهش می­ دهند. کمبود آب، موجب بسته­شدن روزنه شده و بنابراین غلظت CO₂ بین­سلولی کاهش می­یابد. این در حالی است که هیدراسیون سلولهای مزوفیل به دستگاه فتوسنتزی صدمه می­رساند . تحت شرایطی که فتوسنتز دچار نقص شده وکلروپلاست­ها در معرض افزایش انرژی بر انگیختگی قرار دارند، کاهش نوری اکسیژن وجود دارد که منتج به تولید پیوسته گونه اکسیژن فعال (ROS) می­ شود که عبارتند از هیدروژن­پر­اکسید، آنیون­سوپراکسید و رادیکال­های هیدروکسیل (and Inzé, ۱۹۹۵ Van Montagu) که به غشا و آنزیم­ها صدمه می­زنند. بنابراین افزایش محصول رادیکال­های اکسیژن در پراکسیداسیون لپیدهای غشا نقش بسزایی دارند (Durães et al., ۱۹۹۴). مالون­دی­آلدهید محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع در فسفولیپیدها بوده است که به عنوان شاخص آسیب رادیکال­های آزاد به غشای سلولی تحت شرایط تنش استفاده می­ شود (Shakirova, 2007). این ترکیب در نتیجه­ پراکسیداسیون چربی­های غیر اشباع به ویژه لینولئیک اسید تولید می­ شود. در واقع رادیکا­ل­های هیدروکسیل و اکسیژن منفرد می­توانند با گروه ­های متیلن واکنش داده و باعث تشکیل گروه ­های دی- ان (Dienes) رادیکال­های لیپید پراکسی و هیدروپراکسیدها شوند، این رادیکال­ها نیز با جذب هیدروژن از اسیدهای چرب غیر اشباع باعث واکنش زنجیروار پراکسیداسیون می­شوند (Smirnoff, ۱۹۹۵). نتایج حاصل از این پزوهش، حاکی از آن است که میزانMDA در ریشه­ رقم زرفام (مقاوم به خشکی) کاهش و در ریشه­ رقم اکاپی (حساس به خشکی) افزایش یافته، اما در اندام هوایی رقم اکاپی میزانMDA کاهش و در اندام هوایی رقم زرفام افزایش نشان داده است. بر اساس نتایج (Tatar et al., ۲۰۰۸) ، خشکی موجب افزایش سطح MDA در گیاهان گندم (Triticum aestivum L.) گشته که در چهاردهمین روز تنش به بالاترین سطح خود می­رسد. علاوه بر این، افزایش سطح MDA تحت تنش خشکی در گیاهان زیتون نیز مشاهده شده است (Bacelar et al., ۲۰۰۷). برگهایی از گیاه گوجه­ فرنگی که تحت تنش خشکی قرار گرفتند، افزایش در پراکسیداسیون لیپیدی را نشان دادند Nasibi, 2011)). با بررسی واکنش سه رقم برنج به تنش شوری دریافتند که تنش شوری سبب تخریب غشاهای سلولی و افزایش تولید مالون­دی­آلدهید شد، که میزان تولید مالون­دی­آلدهید در رقم حساس به شوری بسیار بیشتر از رقم مقاوم به شوری بود Bhattacharjee and Mukherjee, 2002)). (Feng et al., ۲۰۰۷)، نشان دادند که میزان MDA تحت تنش UV-B و خشکی افزایش می­یابد که در این بین UV-B اثر بیشتری بر این پارامتر نسبت به تنش همزمان و خشکی دارد. علاوه بر این ، کاهش در مقدار MDA تحت تنش هم­زمان در مقایسه با اثر هر یک از تنش­ها بطور جداگانه در سویا (Glycin max L.) به اثبات رسیده استAmal et al., ۲۰۱۰) ).
مشخص شده است که تنش آبی منجر به برخی تغییرات در محتوای کربوهیدرات­ها و پروتئین­ها می­ شود. در برگ گیاهان تحت تنش آبی عموما قند محلول انباشته می­ شود ، درحالی­که، نشاسته و پروتئین نسبت به شاهد به مقدار کمی کاهش می­یابند. این ترکیبات osmoprotectants نقش مهمی در تنظیم اسمزی و حفاظت اسمزی بازی می­ کنند (Godallah et al., ۱۹۹۹ Jones and Hammond–Kosack, 2001;). از جمله مکانیسم­هایی که گیاهان در مقابله با تنش بکار می­گیرند سنتز پروتئین­هاست. میزان پروتئین محلول یکی از شاخصه­های مهم وضعیت فیزیولوژی در گیاهان می­باشد. تغییرات هیدراسیون پروتئین یکی از نتایج میزان یون بالا در تنش اسمزی در سلول­های گیاهی محسوب می­ شود (Parvaiz and Satyavati, 2008). برخى از پژوهش­گران رکود سنتز پروتئین را به کاهش تعداد پلى­زوم­هاى سلولى نسبت داده­اند Creelman et al., ۱۹۹۰)). نتایج حاصل از این مطالعه، بیانگر آن است که میزان پروتئین کل در کل Seedling در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش نشان داده است. علت افزایش پروتئین ممکن است به این دلیل باشد که تنش باعث تحریک افزایش پروتئین­های موجود گردیده و یا پروتئین­های جدیدی سنتز شده باشند (.(Abolhasani Zeraatkar et al., ۲۰۱۰ محتوای پروتئین محلول در گیاه angustifolius Lupinus در معرض تنش خشکی و شوری تحت ﺗﺄثیر قرار نگرفت و محتوای پروتئین در ریشه و برگ­های جوان و قدیمی آفتابگردان (annuus Helianthus) و blumei Coleus کاهش نشان داد (Dos Santos et al., ۱۹۹۹ ؛Gilbert et al., ۱۹۸۹). گزارش کردند که کل پروتئین محلول به میزان قابل توجهی در لوبیا (Phaseolus vulgaris) حساس به شوری کاهش می­یابد، اما درگیاهان P.acutifolius متحمل به شوری افزایش می­یابد۲۰۰۴) .(Yurekli et al., این نتایج مختلف در تنش شوری نشان داد که پاسخ به تنش شوری بستگی به گونه­ های گیاهی و حتی در ارقام همان گونه گیاهی، مرحله رشد گیاه، طول مدت و میزان کاربرد نمک دارد (Parvaiz and Satyavati, 2008).
Agarwal and shaheen, 2007))، دریافتند که کاهش در غلظت پروتئین می ­تواند علامت نوعی از تنش اکسیداتیو بوده و در گیاهان تحت تنش خشکی مشاهده می­ شود. پروتئین­های محلول بطور قابل توجهی با سن گیاه ارتباط داشته و تحت تنش آبی در مقایسه با شاهد افزایش می­یابد. نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج (nasibi and kalantary, 2005)، در گیاه کلزا (Brassica napus) هم­خوانی دارد.
تنش خشکی بر متابولیسم قندها در گیاهان تأثیر می­ گذارد. قندها به صورت­های گوناگون در بردباری به خشکی در گیاهان شرکت می­ کنند. قندها می­توانند به عنوان متابولیت­های سازگار یا اسمولیت­ها سبب تنظیم اسمزی شوند. همچنین سبب پایداری غشا و پروتئین­های در حال خشک­شدن می­گردند، بدین صورت که تثبیت غشاء از طریق جایگزین شدن آب موجود در غشای لیپید­ی دو لایه صورت می­گیرد و به این ترتیب از متراکم شدن فسفولیپیدها جلوگیری کرده و همچنین از پیوندهای نابجا بین پروتئین­های غشایی جلوگیری می­ کنند. پایدارسازی پروتئین­ها نیز از طریق تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین گروه ­های کربوکسیل قند و زنجیره­های قطبی پروتئین صورت می­گیرد .(Ingram and Bartles, 1996)
تجمع قند محلول در سلول گیاهی تحت تنش شوری یا خشکی، پاسخ شایعی می­باشد. این ترکیب osmoprotectant نقش مهمی در تنظیم اسمزی و حفاظت اسمزی بازی می­ کنند (Jones and Hammond–Kosack, 2001).
نتایج حاصل از این پژوهش، بیانگر آن است که میزان قند محلول در کل Seedling در هر دو رقم زرفام (مقاوم به خشکی) و اکاپی (حساس به خشکی) افزایش نشان داده است. تجمع بیش از حد قند در بسیاری از گونه­ های گیاهی در معرض شوری، خشکی و UV-B گزارش شده است (Ranjbarfordoei et al., ۲۰۰۹ Musil et al., ۲۰۰۲;). قندهای محلول ممکن است به عنوان یک osmoprotectant، در برقراری ثبات در غشاء سلولی و حفظ فشار تورگر عمل نمایند.
۴-۳ نتیجه ­گیری کلی
سیگنالینگ تنش غیرزیستی باتوجه به افزایش در بهره­وری گیاهان بخش مهمی را تشکیل می­دهد. بنابراین درک بنیادی مکانیسم­های زیربنایی عملکرد ژن­های تنش، برای توسعه گیاهان تراریخت با اهمیت است. با توجه به نتایج بدست آمده از طریق بررسی­های مولکولی روی دو رقم حساس و مقاوم کلزا در این پژوهش، امید است این مطالعات، اصول استراتژی­ های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش، به ما ارائه کنند. نتایج انجام یافته در سطح مولکولی بیانگر رابطه سطوح فیزیولوژیک و مولکولی با یکدیگر می­باشند. میزان پراکسید­هیدروژن بعد از قرار­گیری گیاه تحت تأثیر تنش افزایش می­یابد، بسیاری ازمحققین معتقدند یک ارتباط نزدیک بین میزان پراکسید­هیدروژن و الگوی MAP کیناز در گیاهان وجود دارد. علاوه بر این مشاهداتی در مورد نقش پراکسید­هیدروژن به عنوان یک سیگنال گزارش شده است. همچنین پیشنهاد کرده ­اند که پراکسید­هیدروژن به عنوان یک پیامبر ثانویه سبب افزایش بیان ژن­های سیستم آنزیمی پاد­اکسایشی می­ شود. کمبود آب، موجب بسته شدن روزنه شده و بنابراین غلظت CO₂ بین سلولی کاهش می­یابد. این در حالی است که هیدراسیون سلول­های مزوفیل به دستگاه فتوسنتزی صدمه می­رساند . تحت شرایطی که فتوسنتز دچار نقص شده وکلروپلاست­ها در معرض افزایش انرژی بر انگیختگی قرار دارند، کاهش نوری اکسیژن وجود دارد که منتج به تولید پیوسته گونه اکسیژن فعال (ROS) می­ شود که به غشا و آنزیم­ها صدمه می­زنند. بنابراین افزایش محصول رادیکال­های اکسیژن در پراکسیداسیون لپیدهای غشا نقش بسزایی دارند. تغییرات ایجاد شده مانند افزایش در میزان فعالیت آنزیم­ های آنتی­اکسیدان، افزایش در متابولیت­هایی مانند پروتئین­ها و قند­ها می­توانند راهکارهای دفاعی بسیار مهمی برای کاهش میزان اثرات تخریبی ناشی از تنش خشکی در گیاه کلزا باشند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که رقم اکاپی (حساس به خشکی) نسبت به تنش خشکی، حساسیت بالایی داشته، و رقم زرفام (مقاوم به خشکی) نسبت به این تنش حساسیت پائینی دارد. بنابراین، رقم زرفام به­عنوان رقم متحمل به خشکی شناخته می­ شود.
۴-۴ پیشنهادات
۱- مطالعه نقش این ژن­ها در جزئیات، درک بیشتری از مکانیسم مولکولی کلزا در پاسخ به تنش خشکی خواهد داد و همچنین اصول استراتژی­ های مهندسی ژنتیک موثری برای بهبود تحمل تنش به ما ارائه خواهد داد.
۲- بررسی تعداد ژن­های بیشتر و سایر ژن­های درگیر در مسیر Signal transduction .
۳- استفاده از Real- Time PCR برای مطالعه بیان ژن­ها.
۴- مطالعه بیان ژن­ها با بهره گرفتن از تکنولوژی DNA Microarray..
۵- مطالعه بیان این ژن­ها تحت تنش­های زیستی از قبیل ویروس­ها و قارچ­ها.
۶- تولید گیاهان تراریخت کلزا متحمل به تنش خشکی با بهره گرفتن از مهندسی ژنتیک.
۷- - باتوجه به اهمیت آنتی­اکسیدان­ها در حفاظت گیاه در مقابل تنش خشکی، پیشنهاد می­ شود که مطالعات آنتی­اکسیدان­ها از نظر کیفی توسط روش­ها و دستگاه­های کارآمد بیشتر مورد ارزیابی قرار گیرند.
۵- ضمائم