جامعه مورد بررسی ماست پروبیوتیک کم چرب (۵/۱ درصد) بود و شامل ۴ تیمار بود که ۳ تیمار مربوط به ماست پروبیوتیک با غلظت ۳۰،۲۰،۱۰ درصد جاشیر و ۱ تیمار مربوط به ماست پروبیوتیک فاقد جاشیر(نمونه شاهد) بود که در ظروف استریل دارای حجم ۱۰۰ گرمی تهیه و در درجه حرارت ۵ درجه سانتیگراد در یخچال نگهداری شدند.
۳-۵ : روش نمونه گیری و حجم نمونه
هر پنج نمونه ماست در روزهای ۱، ۷، ۱۴ و ۲۱ پس از تولید (مدت زمان قراردادی عمر محصول) از نطر خواص فیزیکو شیمیایی (آب انداختگی، اسیدیته) و خواص حسی (طعم، بو، احساس دهانی ، احساس غیر دهانی و رنگ) و زنده مانی باکتری پروبیوتیک مورد استفاده (لاکتوباسیلوس کازئی) آزمایش شدند. حجم نمونه که شامل چهار نوع ماست پروبیوتیک حاوی ۱۰، ۲۰ و ۳۰ درصد جاشیر و ماست پروبیوتیک فاقد جاشیر بود، با توجه به نوع تولید ۱۴۴ نمونه ( ۳۶ نمونه شاهد و ۱۰۸ نمونه مورد) در نظر گرفته شد که این نمونه ها هرکدام ۱۰۰ گرم بود. آزمایشات مذکور روی نمونه ها در روزهای ۱، ۷، ۱۴و ۲۱ پس از تولید و طی سه تکرار انجام شد.
۳-۶ : روش گردآوری داده ها
۳-۶-۱ : کل اسیدیته قابل تیتراسیون^۸۰
۱ میلی لیتر نمونه ماست به طور کامل با ۹ میلی لیتر از محلول آب مقطر و ۳ قطره فنل فتالئین الکلی(۰۰۰۱/۰% الکل) مخلوط و سوسپانسیون ماست با بهره گرفتن از سود ۱/۰ نرمال تیتر شد. مخلوط به طور مداوم هم زده شد و تیتراسیون تا زمانیکه رنگ صورتی مشخص که به مدت ۳۰ ثانیه ثابت ماند، تشکیل شد. حجم سود مورد نیاز برای خنثی کردن اسید موجود در ماست ثبت شد سپس محتوی اسید قابل تیتراسیون (درصد اسید لاکتیک معادل آن) با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه گردید. برای سنجش اسیدیته قابل تیتر محصول از روش استاندارد ملی ایران به شماره ۲۸۵۲ استفاده شد (۵۹).

فرمول شماره ۲:
LA% =10×V NaOH×۰٫۰۰۹×۰٫۱×۱۰۰%/W
۱۰ = عامل رقت
W = وزن نمونه
VNaOH = حجم سود مصرفی برای تیتراسیون
۰٫۱ = نرمالیته سود
۳-۶-۲ : اندازه گیری آب اندازی
برای اندازه گیری آب اندازی از کاغذ واتمن شماره ۴۰ استفاده شد. به این صورت که ۵۰ گرم از هر نمونه ماست روی توری ریخته و به مدت یک ساعت در دمای ۵ درجه گذاشته و مقدار آب جدا شده اندازه گیری شد (مظلومی و همکاران، ۲۰۱۱) (۵۳).
فرمول شماره ۱: درصد آب اندازی = وزن محلول عبور کرده (گرم) تقسیم بر وزن نمونه ماست (گرم) ضربدر ۱۰۰
۳-۶-۳ : ارزیابی حسی
ارزیابی حسی محصول با روش استاندارد ملی ایران به شماره ۶۹۵ (ماست- ویژگی ها و روش های آزمون) و پرسشنامه طراحی شده براساس جدول موجود در این استاندارد انجام شد. پرسشنامه به کار رفته شامل عنوان پرسشنامه، اطلاعاتی در مورد نحوه انجام آزمون حسی و نحوه تکمیل پرسشنامه و هفت جدول (برای درج اطلاعات شخصی افراد ( پانلیست ها)، کد نمونه، جدول سوالات راجع به خصوصیات کیفی محصول) تنظیم شده بود که دارای درجه بندی ۵ نمره ای برای هر خصوصیت حسی (طعم، بو، ظاهر، رنگ و احساس دهانی) بود ( خیلی خوب = بسیار رضایت بخش=۴، خوب = رضایت بخش=۳، متوسط = قابل قبول=۲، ضعیف = غیر قابل قبول=۱ و خیلی ضعیف = غیر قابل مصرف =۰) (۵۹).
ارزیابی حسی نمونه ها با بهره گرفتن از یک پانل از افراد آموزش دیده در آزمایشگاه مرجع معاونت غذا و داروی دانشگاه علوم پزشکی شیراز مورد بررسی قرار گرفت. نمونه فرم ارزیابی حسی در صفحه پیوست آورده شد.
۳-۶-۴ : شمارش میکروبی در ماست‌ پروبیوتیک
در ماست‌های پروبیوتیک تولید شده، جهت شمارش لاکتوباسیلوس کازئی از محیط کشت MRS ونکومایسین آگار^۸۱ استفاده شد. به این منظور پس از همگن نمودن نمونه های ماست، ۱۰ گرم از هر یک از نمونه ها به شیشه های درپوش دار حاوی۹۰ میلی لیتر بافر استریل نرمال سیلین+۱/۰ درصد پپتون اضافه شده و با تکان دادن کاملا همگن می شد. پس از آن رقت های بعدی تهیه گردید. مقدار ۱/۰ میلی لیتر از رقتهای ^۴-۱۰، ^۵-۱۰ و ^۶-۱۰ به صورت پورپلیت در محیط ذکر شده در بالا، تلقیح شد ( Aryana, McGre, 2007).
۳-۷ : ابزار گرد آوری داده ها:
مواد شیمیایی: مواد مورد استفاده در آزمایش ها شامل شیر ۱٫۵ درصد چربی (شرکت پگاه فارس)، بافرهای ۴ و ۷ و ۹ برای کالیبره کردن PH متر، محلول سود ۰٫۱ نرمال، معرف فنل فتالئین الکلی، نمک مرک، استارتر لیوفیلیزه (DVS) سنتی ماست، استارتر لیوفیلیزه لاکتوباسیلوس کازئی، گیاه جاشیر، محیط کشت MRS آگار (مرک آلمان)، آنتی بیوتیک ونکومایسین (سیگما آلدریچ)، پپتون واتر (مرک آلمان) ، بود.
ابزار و وسایل: بشر ۱۰۰ میلی لیتر، استوانه مدرج ۱۰۰ و ۲۵۰ و ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میلی لیتر ، قیف شیشه ای، کاغذ واتمن شماره ۴۰، پیپت ۱۰ و ۵ میلی لیتر، بورت مدرج، پایه و گیره، شیشه درپیچ دار ۲۰۰ و ۵۰۰ و ۱۰۰۰ میلی لیتر، دستگاه کلنی شمار، پلیت یکبار مصرف، کاسه یکبار مصرف، دستگاه اتوکلاو، بن ماری ۱۰۰ درجه سانتی گرادی، هود میکروبیولوژی و گرمخانه (انکوباتور)، pH متر (مدل ۸۷۲ مترهلم سوئیس)، پرسشنامه .
روش تهیه سود ۰٫۱ نرمال : مقدار ۴۰ گرم پودر هیدروکسید سدیم را درون ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر بون گاز حل شد و محلول حاصل برای تعیین نرمالیته دقیق با بی فتالات پتاسیم تیتر شد (زیبا حسینی، ۱۳۸۲) (۶۰).
روش تهیه آب مقطر بدون گاز : مقدار لازم آب مقطر درون ارلن ریخته شد و بمدت نیم ساعت در حال جوشیدن روی شعله ماند و سپس سرد و با درپوش غیر قابل نفوذ به هوا درب ارلن بسته شد (۶۰).
روش تهیه محلول بی فتالات پتاسیم : برای تهیه محلول ۱/۰ نرمال بی فتالات پتاسیم ۲/۱۰ گرم از پودر آن به دقت وزن شد و در آب مقطر بدون گاز کربنیک حل گردید سپس در یک فلاسک حجمی حجم به ۵۰۰ میلی لیتر رسانده شد (۶۰).
روش تیتراسیون سود با بی فتالات پتاسیم : ۲۰ میلی لیتر از بی فتالات پتاسیم در یک بشر ۱۵۰ میلی لیتری ریخته شد و سه قطره شناساگر فنل فتالین ( ۵/۰ درصد در الکل ۵۰ درصد) به آن افزوده شد. با یک بورت هیدروکسید سدیم قطره قطره به محلول اضافه گردید و این عمل تا ظاهر شدن رنگ ارغوانی روشن ادامه یافت. تیتراسیون در سه تکرار انجام شد و معدل گیری شد. اختلاف میزان سود مصرفی در سه تکرار نباید بیشتر از ۱/۰ می بود (۶۰).
تهیه محیط کشت ام آر اس آگار ونکومایسین دار : محیط کشت MRS agar از شرکت مرک آلمان خریداری شد. ابتدا مقدار ۶۸٫۲ گرم از محیط کشت MRS-agar در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر کاملا حل و جوشانده شد تا کاملا یکنواخت و شفاف گردید. محلول حاصل در ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید. سپس محیط کشت را از اتوکلاو خارج کرده و دمای آنرا با آب سرد به محدوده ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتیگراد پایین آورده و زیر هود میکروبیولوژی و در شرایط استریل (کنار شعله و با سرنگ استریل) ۲ میلی لیتر از محلول ونکومایسین به آن اضافه شد. در نهایت محیط کشت تا زمان شروع کشت میکروبی در انکوباتور ۵۰ درجه (برای جلوگیری از جامد شدن) نگهداری گردید. از این محیط کشت جهت شمارش لاکتوباسیلوس کازئی در ماستهای تولیدی استفاده شد ( Aryana, McGrew, 2007).
روش تهیه محلول ونکومایسین : ویال ونکومایسین از شرکت سیگما الدریچ^۱۳۷ خریداری شد. مقدار ۱۰ میلی گرم از پودر ونکومایسین در شرایط استریل توزین و به ۲۰ میلی لیتر آب مقطر درون شیشه های درپیچ دار اضافه شد. سوسپانسیون را به خوبی با دستگاه تکان دهنده^۱۳۸ هم زده تا کاملا حل گردید. سپس زیر هود میکروبیولوژی و کنار شعله محلول حاصل توسط سرنگ استریل برداشت شد. سرنگ حاوی محلول به فیلتر سرسرنگی استریل وصل گردید. زیر فیلتر یک شیشه درپیچ دار استریل (برای جمع آوری محلول فیلتر شده) قرار گرفت. محلول به فیلتر تزریق و در شیشه جمع آوری گردید ( Aryana, McGrew, 2007).
۳-۸ : روش تجزیه و تحلیل داده ها :
۳-۸-۱ : آنالیز آماری داده های بدست آمده بوسیله نرم افزار ۱۶SPSS، با بکارگیری آزمون یک طرفه واریانس و جهت تفاوت بررسی در میانگین ها از ضریب خطای %۵=α استفاده شد. میانگین و انحراف معیار تعداد باکتری های پروبیوتیک لاکتوباسیلوس کازئی در هر میلی لیتر از محصولات پروبیوتیک با غلظت های ۱۰، ۲۰ و ۳۰ درصد جاشیر و ماست پروبیوتیک بدون جاشیر ( به عنوان کنترل ) در هر نمونه گزارش شد. میانگین های تیمارها نیز با روش دانکن مقایسه گردید. همچنین از آزمون (Repeated measurement) برای بررسی میانگین نمونه های تکراری استفاده شد.
۳-۸-۲ : در مورد ویژگی های کمی از آمار توصیفی به کمک میانگین یا میانه و انحراف معیار استفاده شد.
۳-۸-۳ : برای ارزیابی حسی ماست های تولید شده بر پایه تیمارهای مورد مطالعه از آزمون کروسکال- والیس و کای دو استفاده گردید.
۳-۹ : مکان و زمان مطالعه : دانشکده تغذیه و علوم غذایی دانشگاه علوم پزشکی شیراز۱۳۹۱-۹۲
۳-۱۰ : محدودیت های پژوهش : گران شدن مواد و وسایل مصرفی بصورت تدریجی و چند برابر
۳-۱۰ : ملاحظات اخلاقی : ندارد
۳-۱۱ : تعریف واژه ها
جدول شماره ۱: متغیرها و تعریف آنها