• ۴ رقت پایین تر از غلظت غیر توکسیک عصاره در محیط DMEM حاوی ۲% سرم آماده شد.

• ۵ چاهک از پلیت با ۱۰۰ TCID50 ویروس تلقیح شد.

• • پس از یک ساعت جذب ویروس به سلول، به ۴ چاهک از چاهک های آلوده به ویروس، ۴ رقت عصاره و به یک چاهک فقط محیط DMEM حاوی ۲ % سرم (برای کنترل ویروس) به میزان۱۰۰۰ میکرولیتر اضافه شد.

• پس از ۴۸ ساعت از هر چاهک برای تعیین عیار ویروس نمونه برداری انجام گردید.

• در پلیت ۹۶ خانه ای حاوی منولایر سلول Hela، تیتر ویروس به روش TCID50 به روی هر نمونه بطور جداگانه مورد سنجش قرار گرفت.

۳-۱۹ بررسی اثر ضد ویروسی عصاره بر مراحل مختلف همانند سازی HSV-1:
در این پژوهش جهت مشخص شدن زمان اثر بخشی عصاره بر همانند سازی ویروس و اینکه جلوگیری از تکثیر ویروس در چه مرحله ای تحقق می یابد، به ترتیب زیر عمل شد. لازم به ذکر است، برای این کار از بالاترین غلظت غیر توکسیک عصاره استفاده شد:

• در یک پلیت ۲۴ خانه ای منولایر سلولی Hela فراهم شد.

• در یک چاهک از ۵ ساعت قبل از تلقیح ویروس ۱ میلی لیتر محیط DMEM حاوی عصاره و ۲% سرم افزوده شد. پس از ۵ ساعت محیط رویی خارج، سلول ها با PBS شسته و به میزان ۱۰۰ TCID50 به آن بذر ویروسی اضافه شد (۲۰۰ میکرو لیتر). بعد از ۱ ساعت جذب، سلول های آلوده شده شسته و محیط DMEM فاقد عصاره و حاوی ۲% سرم افزوده شد.

• در چاهک دیگری عملیات بالا در زمان ۲ ساعت قبل از تلقیح ویروس صورت گرفت.

• برای بررسی اثر عصاره در حین جذب، بلافاصله بعد از آماده سازی ۱۰۰ TCID50 ویروس در DMEM حاوی عصاره، سوسپانسیون ویروسی به سلول های شسته شده با PBS تلقیح شد (۲۰۰ میکرولیتر). پس از ۱ ساعت جذب محیط رویی خارج شده و پس از شستشو به آن۱۰۰۰ میکرولیتر DMEM فاقد عصاره حاوی ۲% سرم افزوده شد.

• در ادامه ۷ چاهک از پلیت را با PBS شسته و به آن ۱۰۰ TCID50 ویروس اضافه کرده، در یک چاهک از چاهک های فوق بلافاصله بعد از یک ساعت جذب ویروسی، محیط DMEM حاوی عصاره و نیز دارای ۲% سرم اضافه گردید و در ۶ چاهک دیگر محیط DMEM حاوی ۲% سرم اضافه شد و پس از یک ساعت بعد از زمان جذب و سپس ۲ ساعت، ۴ ساعت، ۸ ساعت، ۱۲ ساعت و ۲۴ ساعت بعد به ترتیب محیط رویی در هر چاهک خارج گردیده و محیط DMEM حاوی عصاره ویروسی و ۲% سرم اضافه گردید.

• برای کنترل ویروس، در یک چاهک جداگانه سلول Hela پس از یک ساعت جذب ویروس، محیط DMEM 2% سرم و فاقد عصاره گیاهی اضافه شد.

• پس از ۴۸ ساعت از زمان آلوده سازی اولیه سلول ها با ویروس، از تمام چاهک ها نمونه برداری صورت گرفت و تیتر ویروس در پلیت ۹۶ خانه ای حاوی منولایر سلولی Hela با روش TCID50 برای هر نمونه بطور جداگانه مورد سنجش قرار گرفت.

فصل چهارم
نتایج
نتایج (Results):
۴-۱ سلول Hela
شکل۴- ۱: منولایر سلول Hela
سلول های Hela یک رده سلولی هتروپلوئید می باشد که از سلول های سرطانی گردنه رحم بدست آمده است از این سلول ها در مطالعات ویروس شناسی به صورت گسترده استفاده می شود. همانطوری که در شکل مشاهده می شود این سلول ها فرم اپیتلیالی داشته و ظرف مدت ۷۲- ۴۸ ساعت بعد از تریپسینه شدن، کف فلاسک کشت سلولی را به خوبی پر می کنند. از ویژگی سلول های Hela می توان به تکثیر نامحدود، تحمل پاساژهای طولانی و قابلیت استفاده برای اکثر ویروس ها اشاره کرد.
۴-۲ سلول های Hela، ۴۸ ساعت پس از آلودگی با Hsv-1
شکل ۴-۲: سلول Hela آلوده به HSV-1
سلول های Hela که تشکیل مونولایر دادند پس از شستشو با PBS توسط استوک ویروسی HSV-1 آلوده شده و به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد حاوی ۵% CO₂ نگهداری می شود اگر سلولهای آلوده شده با ویروس را با سلول های سالم مقایسه کنیم خواهیم دید که سلول ها از حالت اپی تلیالی خود خارج شده و تبدیل به سلول های گرد و کروی می شوند.
۴-۳ تعیین عیار ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک به روشTCID50

رقت ویروس
نسبت چاهک های
CPE دار به کل
چاهک های
CPE دار
چاهکهای
سالم
جمع تصاعدی
چاهک های CPE دار
جمع تصاعدی
چاهک های
سالم
نسبت
درصد CPE
در کل چاهکها

۴
۰