فصل دوم
مروری بر پژوهش های پیشین
آسپیرین دارویی برای درمان سردرد، تب، روماتیسم مفصلی، بیماری های قلبی- عروقی و سرطان است. با توجه به مصرف زیاد آسپیرین در دنیا بررسی تاثیرات این دارو بر روی سیستم فیژیولوژیکی و پروتئین های بدن ضروری به نظر می رسد. Pinckard و همکاران در سال ۱۹۶۸ نشان دادند که آسپیرین توانایی استیله کردن ترکیبات سلولی مانند پروتئین ها، هورمون ها و اسیدهای نوکلئیک را دارد.
مطالعات متعددی در خصوص بررسی اثر استیلاسیون به وسیله ی آسپیرین بر روی عملکرد زیستی پروتئین های مختلف صورت گرفته است. در ادامه شرح پژوهش های انجام شده در ارتباط با تاثیر آسپیرین بر روی پروتئین های مختلف آمده است.
Hawkinsو همکاران در مطالعات مختلف در سال های ۱۹۶۸ و ۱۹۶۹ نشان دادند که آسپیرین توانایی استیله کردن آلبومین سرم انسانی در شرایط آزمایشگاهی و درون بدن را دارد. استیلاسیون این پروتئین سبب تغییر ساختار فضایی آن می گردد. آلبومین استیله دارای الگوی پپتیدی متفاوتی در مقایسه با پروتئین طبیعی می باشد. برش پروتئین آلبومین طبیعی سرم انسانی با آنزیم تریپسین منجر به تولید دو قطعه Bو C می شود، در حالی که تأثیر تریپسین بر شکل استیله این پروتئین همراه با تولید یک قطعه موسوم به قطعه ی A می باشد. به نظر می رسد که این تغییر به دلیل تشکیل ترکیب N- استیل با گروه ε- آمین اسید آمینه ی لیزین می باشد.
Minden و همکاران در سال ۱۹۶۷ و Honma و همکاران در سال ۱۹۹۱ گزارش کردند که در سرم افراد مبتلا به بیماری روماتیسم مفصلی که داروی آسپیرین مصرف می کنند آنتی بادی علیه آلبومین استیله وجود دارد. به نظر می رسد که آسپیرین با استیلاسیون این پروتئین موجب بروز پاسخ ایمنی در بدن می شود.
در مطالعاتی که توسط Walder و همکاران در سال ۱۹۷۷ و Shamsuddin و همکاران در سال ۱۹۷۴ بر روی هموگلوبین (HbA[70] , HbS[71]) صورت گرفت مشخص شد که هر دو زنجیره آلفا و بتای هموگلوبین به وسیله ی آسپیرین استیله می شود. بیشترگروه های استیل به لیزین های ۵۹، ۹۰ و ۱۴۴ در زنجیره بتای این پروتئین متصل می شود. با وجود اینکه Klotz و همکاران در سال ۱۹۷۳ گزارش کردند که این تغییر شیمیایی تمایل HbS برای مولکول اکسیژن را افزایش می دهد، مطالعه بعدی در سال ۱۹۸۳ توسط Greenberg این نتیجه را تائید نکرد.
Roth و همکاران در سال ۱۹۷۵ گزارش کردند که استیلاسیون پلاکت ها به مهار عملکرد آن منجر می شود.
Bjornsson و همکاران در سال ۱۹۸۸ مشاهده کردند که آسپیرین در شرایط آزمایشگاهی و در بدن پروتئین فیبرینوژن را استیله می کند. N- استیلاسیون باقی مانده لیزینی این پروتئین احتمال هضم لخته های فیبرین را افزایش می دهد.
Roth و همکاران در سال ۱۹۸۳ به بررسی اثر آسپیرین بر روی آنزیم های سیکلواکسیژناز ( Cox ) پرداختند. این گروه نشان دادند که آسپیرین به طور انتخابی گروه هیدروکسی باقی مانده سرین ۵۳۰ در آنزیم Cox-1 را استیله می کند. این تغییر شیمیایی ایجاد شده موجب مهار برگشت ناپذیر فعالیت سیکلواکسیژنازی این آنزیم می گردد.
Vane و همکاران در سال ۱۹۹۸گزارش کردند که آسپیرین به سرین ۵۱۶ در جایگاه فعال آنزیم Cox-2 وصل می شود. البته به دلیل بزرگتر بودن جایگاه فعال آنزیم Cox-2، درجه مهار آسپیرین برای این آنزیم نسبت به Cox-1 کمتر می باشد. با غیر فعال شدن آنزیم های سیکلواکسیژناز تولید پروستاگلاندین ها که مسئول ایجاد تب، درد و التهاب می باشند، کاهش می یابد.
آسپیرین به عنوان یک عامل ضد قندی شدن از طریق استیله کردن گروه های آمین آزاد در پروتئین ها عمل می کند و مانع تشکیل محصول آمادوری و محصول پیشرفته قندی شدن غیر آنزیمی می گردد. قندی شدن غیر آنزیمی پروتئین از عوارض ثانویه دیابت شیرین است. بنابراین فرایند استیله شدن پروتئین ها با آسپیرین می تواند این عارضه را کاهش دهد.
در مطالعات انجام شده در سال ۱۹۹۳ توسط Cherian و Qin مشخص شد که آسپیرین با استیله کردن اسیدآمینه های لیزین و سیستئین در گاما کریستالین لنز و ممانعت از قندی شدن آن اثر حفاظتی در برابر بیماری آب مروارید دارد.
Hadley و همکاران در سال ۲۰۰۱ پیشنهاد کردند که آسپیرین با استیله کردن پروتئین های کلاژن قرنیه مانع از قندی شدن آن در حضور گلوکز می شود.
طی پژوهشی که در سال ۱۹۸۶ توسط Rendell و همکاران صورت گرفت مشخص شد که آسپیرین توانایی مهار قندی شدن پروتئین های آلبومین و هموگلوبین از طریق استیلاسیون در شرایط آزمایشگاهی و در بدن را دارا می باشد. این پدیده می تواند در عملکردهای پروتئین آلبومین مانند خصوصیات اتصال به لیگاند آن تداخل ایجاد کند.
تاثیر داروهای ضد التهابی غیر استروئیدی (آسپیرین، ایپوپروفن، ناپروکسن و کتوپروفن) بر روی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین های آمیلین و بتا آمیلوئید در شرایط آزمایشگاهی انجام شده است.
Thomas و همکاران در سال ۲۰۰۳ نشان دادند که داروهای ضد التهابی غیر استروئیدی مانند آسپیرین با ممانعت از تشکیل صفحات بتا در پروتئین آمیلین انسانی سبب مهار فرایند توده ای شدن این پروتئین در حضور ترکیب واسرشت کننده ی تری فلوئورو اتانول می شود. در مطالعه Hirohata و همکاران در سال ۲۰۰۵ نشان داده شد که داروهای ضد التهابی غیر استروئیدی مانند آسپیرین اثر ضد آمیلوئیدوژنیک دارد و در شرایط آزمایشگاهی تشکیل فیبریل های بتا- آمیلوئید (Aβ) را مهار می کند.
تاکنون مطالعه ای در مورد تاثیر استیلاسیون به وسیله ی عوامل استیله کننده مانند آسپیرین بر روی فیبریلاسیون پروتئین انسولین گزارش نشده است. قابل ذکر است در پژوهشی که توسط Lindsay وهمکاران در سال ۱۹۷۰ انجام شد مشاهده کردند که استیلاسیون گروه آمین لیزین ۲۹ انسولین با ترکیب N-هیدروکسی سوکسینیمید استات تاثیری بر روی فعالیت زیستی این هورمون ندارد. علاوه بر لیزین ۲۹، گروه های آمین انتهای دو زنجیره ی آلفا و بتای انسولین نیز قابلیت استیله شدن دارند. از این رو احتمالا الگوی استیلاسیون در حضور آسپیرین با آنچه در حضور ترکیب شیمیایی فوق الذکر انجام شده است متفاوت می باشد. در این پژوهش اثر استیلاسیون به وسیله ی داروی پرمصرف آسپیرین بر ساختار و ویژگی های آمیلوئیدی این هورمون مطالعه می شود.
اهداف پژوهشی
همانطور که پیشتر بیان شد آسپیرین داروی تجویزی برای افراد دیابتی به منظور کنترل و یا درمان عوارض قلبی– عروقی ناشی از این بیماری است. از آنجایی که آسپیرین به عنوان داروی درمانی در غلظت های مختلف استفاده می شود، امکان دارد که مصرف مکرر آن حتی در مقادیر کم و در بلند مدت به استیله شدن پروتئین هایی با نیمه عمر طولانی منجر شود (Alfonso و همکاران ۲۰۰۹). تغییرات ساختاری انسولین و تمایل این هورمون برای فرایند توده ای شدن یا تشکیل فیبر آمیلوئیدی در حالت استیله از منظر پزشکی اهمیت بسزایی دارد. با توجه به اینکه پروتئین انسولین به عنوان پروتئین مولد فیبر آمیلوئیدی شناخته شده است در این پژوهش بر آن شدیم تا تاثیر آسپیرین به عنوان عامل استیله کننده بر روی ساختار و ویزگی های آمیلوئیدی این پروتئین را بررسی کنیم.
هدف اصلی این پژوهش بررسی ساختار و خصوصیت آمیلوئیدی انسولین استیله و غیر استیله می باشد. در این پژوهش تاثیر استیلاسیون بر ساختار دوم و سوم انسولین بررسی می شود. بررسی محتوای ساختار دوم با دستگاه دورنگ نمای دورانی و مطالعه ی ساختار سوم انسولین به کمک دستگاه فلورسانس انجام می شود. از آنجایی که در مسیر فرایند توده ای شدن پروتئینی یا تشکیل فیبر آمیلوئیدی حد واسط هایی با وزن مولکولی بالا تشکیل می شود که گاها فوق العاده سمی می باشند هدف دیگر این پژوهش مطالعه پیدایش این حد واسط ها ضمن استیله شدن انسولین است که به کمک دستگاه پراکنش پویای نور (DLS) و روش SDS-PAGE در شرایط احیایی و غیر احیایی انجام می شود. از دیگر اهداف این پژوهش مقایسه سمیت فیبر آمیلوئیدی انسولین در دو حالت استیله و طبیعی است. همچنین مطالعه تشکیل فیبر آمیلوئیدی انسولین به کمک آزمون های نشر فلورسانس ThT، جذب کونگوی قرمز و همچنین به وسیله ی میکروسکوپ فلورسانس انجام می گیرد.
فصل سوم
مواد و روش های تحقیق
۳-۱- مواد مصرفی و رده ی سلولی
۳-۱-۱- مواد مصرفی
انسولین پانکراس گاوی (BPI)، آسپیرین ، دی تیو تریتول (DTT)، کلرید سدیم، کیسه دیالیز، آکریل آمید، بیس آکریل آمید، رنگ های حیاتی(تریپان بلو[۷۲] و [۷۳]MTT)، RPMI[74]، DMF[75]، پلیت کشت سلولی ۹۶ خانه ای، تریس آمین، سدیم دو دسیل سولفات([۷۶]SDS)، NaH2PO4،Na2HPO4 ، آمونیوم پرسولفات ،TEMED[77]، رنگ کنگوی قرمز، تیوفلاوین T(ThT)، اُ- فتالدهید[۷۸] (OPA)، آنیلینو- نفتالین- سولفونیک اسید(ANS)، مرکاپتواتانول، اوره، تری فلوئورواتانول[۷۹] (TFE) و فلورسامین[۸۰].
۳-۱-۲- رده ی سلولی
در این پژوهش از رده ی سلولی Jurkat استفاده شد. در محیط RPMI-1640 حاوی ۱۰ درصد FBS[81] و در محیط مرطوب و شرایط دمایی ۳۷ درجه سانتی گراد و ۵ درصد CO2 نگهداری شد.
۳-۲- تهیه محلول ها
۳-۲-۱- تهیه محلول های مورد نیاز کشت سلول سرطانی
۳-۲-۱-۱- تهیه محلول MTT
پودر زرد زنگ MTT ابتدا در بافر فسفات سالین[۸۲] (PBS) حل شد به طوری که غلظت نهایی آن ۲/۴ میلی گرم در میلی لیتر بود. سپس محلول MTT به منظور گند زدایی و حذف ذرات نامحلول احتمالی که در برخی نمونه های MTT وجود دارد از فیلتر ۲/۰ میکرو متری عبور داده شد و در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد. نگهداری محلول بیش از ۴ روز در دمای ۴ درجه سانتی گراد باعث تجزیه ترکیب وایجاد خطا در نتایج می گردد.
۳-۲-۱-۲- تهیه محلول تریپان بلو جهت رنگ آمیزی و شمارش سلول های زنده و غیر زنده
این محلول جهت رنگ آمیزی و شمارش سلول های زنده و غیر زنده به کار می رود. محلول تریپان بلو برای رنگ آمیزی سلول v) /w) 4/0 درصد تهیه می شود (Farndale و همکاران ۱۹۸۶). برای تهیه یک میلی لیتر محلول تریپان بلو ۴ میلی گرم پودر تریپان بلو در یک میلی لیتر PBS حل و در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری می شود.
۳-۲-۱-۳- تهیه محلول SDS-DMF
این محلول شامل SDS 10 درصد، DMF 50 درصد و H2O 40 درصد می باشد. به منظور تهیه ۱۲ میلی لیتر از این محلول ۲/۱ گرم پودر SDS، ۶ میلی لیتر محلول DMFو ۸/۴ میلی لیتر آب استفاده شد.
۳-۲-۲- تهیه ی محلول های پروتئینی
۳-۲-۲-۱- تهیه ی محلول انسولین
مقدار جذب با غلظت نمونه اغلب رابطه خطی دارد و از قانون بیرلامبرت تبعیت می کند (A= ɛ.C.L).
در این معادله A مقدار جذب (OD) را نشان می دهد. جذب یک عدد بدون واحد بوده و معمولا محدوده بهینه آن برای تعیین غلظت ماکرومولکول ها بین ۲/۰ تا ۸/۰ می باشد. در غلظت های زیادتر یا کمتر انحراف مثبت یا منفی از قانون بیرلامبرت مشاهده می شود. در این رابطه ɛ ضریب جذب یا ضریب خاموشی است که به تعداد اسیدهای آمینه سیستئین منفرد، تیروزین و اسیدهای آمینه آروماتیک (که دارای خاصیت ذاتی کروموفور است) بستگی دارد. ضریب جذبی بیش تر نشان دهنده ی تمایل بیشتر کروموفور برای جذب نور است. در این رابطه C غلظت نمونه پروتئینی و L طول مسیر طی شده به وسیله ی نور است که معمولا ۱ سانتی متر می باشد. مقدار ضریب جذبی بالای اسید آمینه های آروماتیک در طول موج ۲۸۰ نانومتر باعث شده است که طول موج یاد شده به عنوان λmax برای تعیین غلظت پروتئین ها به کار رود. هر پروتئین ضریب جذبی مختص به خود را دارد که برای تعیین غلظت به سادگی با خواندن مقدار جذب در λmax آن می توان غلظت نمونه پروتئینی را تعیین کرد. ضریب جذب ( ɛ۲۷۶) برای هورمون انسولین پانکراس گاوی معادل mg-1 ml-1 ۰۸/۱ به ازای هر ۱ میلی گرم در میلی لیتر است.
برای تهیه ی محلول انسولین، مقدار این پروتئین در حداقل حجم سود ۱/۰ مولار حل شد. بعد از اضافه کردن بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار ۴/۷ pH به آن به وسیله ی دستگاه اسپکتروفتومتر مدل T90+ UV/Vis و ضمن خواندن جذب ۲۷۶ نانومتر تعیین غلظت شد.
شکل ۳-۱- نمایی از طیف جذبی انسولین.
۳-۲-۲-۲- تهیه محلول های بتاکازئین و آلفاکریستالین
استوک پروتئین های تخلیص شده بتاکازئین و آلفاکریستالین که در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار حل شده بود با توجه به ضریب جذب یا اپسیلون بتاکازئین و آلفاکریستالین (به ترتیب mg-1 mL-1 ۴۸/۰و ۸۵/۰)، ضریب رقت و با بهره گرفتن از معادله ی A=εCL تعیین غلظت شد (Yousefi و همکاران ۲۰۰۹ ،Khanova و همکاران ۲۰۱۲).
۳-۲-۳- تهیه ی محلول های مورد نیاز
۳-۲-۳- ۱- تهیه محلول بافر فسفات
در این پژوهش بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷pH استفاده شد. این بافر حاوی نمک مونو سدیم فسفات (NaH2PO4) و نمک دی سدیم فسفات (Na2HPO4) می باشد.
جدول۳-۱- مقادیر لازم برای تهیه ی ۱ لیتر بافر فسفات
