قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ هفتم یک محل برش برای آنزیم های BamHI, HindIII, PaeI, PstI, SalI, SmaI, XbaI ، دو محل برش برای آنزیم های SacI XmiI,، و چهار محل برش برای آنزیم HincII نشان میدهد. بررسی موتاسیونهایی که در این کانتیگ وجود دارند نشان داده است که هیچ یک از آنها در محل برش این آنزیم های برشی واقع نشدهاند.
تعداد ژنوتیپهای حامل موتاسیون در محل هضم آنزیم های برشی در قطعه کامل توالی بیان شده ژن CBL4، ۶ ۱۵ ژنوتیپ و در قطعه کامل توالی بیان شده ژن HKT1، ۸۵ ژنوتیپ بوده است.
۳-۹ آنالیز ژن HKT1 براساس قطعات تکثیری پرایمرها
۳-۹- ۱ آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
پرایمر HKT1-1 موجب تکثیر قطعه bp 560 از بخش ابتدایی ژن HKT1 گردیده که توالی نوکلئوتیدی این قطعه در شکل ۳- ۱۸ نشان داده شده است.
۱TCGCACTCATATATAGCACCATGGGTTGGGTGAAAAGATTTTACCAAGATTTCATCCATA
۶۱TCAAGCTGCATAGCTTTTGCCGTATCAGTAGATATGTTGTCGATTCAATAGCTTTTGTCT
۱۲۱ATCGATTTGTTGCATTGCATGTTCACCCCTTCTGGATCCAACTGTCCTACTTCCTTGCCA
۱۸۱TTGCTATACTTGGTTCAGTCCTCTTGATGTCGCTGAAACCAAGCAACCCCGACTTCAGCC
۲۴۱CTCCTTACATTGACATGTTATTCTTGTCAACTTCTGCTCTAACAGTTTCTGGCCTCAGCA
۳۰۱CCATCACGATGGAGGACCTCTCAAGCGCTCAAATTGTGGTCTTGACACTGCTCATGCTTG
۳۶۱TAGGAGGGGAGATCTTTGTTTCACTCTTAGGGCTCATGCTTAGAGTGAACCATCAAGACA
۴۲۱TGCCAGATCTTCCAAGAGTGAAGATCAGCTCAGTTCCTGTCGAGCTTGAAGAGATAGACT
۴۸۱TGGCCAACAGCATGGCACTCTCTGATGAGTCACAGCTTGAAGAAGCAACTCATGCAATTA
۵۴۱ CACCCAAGAAATGTACAGGG
شکل ۳- ۱۸ توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1
این قطعه ژنومی در کلیه ژنوتیپهای آزمایشی با پرایمر HKT1-1 تکثیر شده و تعیین توالی گردید و سپس توالی آنها به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با توالی مربوط در شاهد مقایسه شد. از طریق این مقایسه، انواع موتاسیونهای موجود بین ژنوتیپهای مختلف مورد مطالعه و شاهد تعیین گردید. همچنین به وسیله این نرم افزار، نقشه هضم آنزیمی نیز به دست آمده است.
۳-۹-۱-۱ موتاسیونهای حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
آنالیز و مقایسه توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 در ۹۶ ژنوتیپ آزمایشی نشان داده است که فقط یک موتاسیون حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری این پرایمر مشاهده شده و شامل حذف یک تک نوکلئوتید در ژنوتیپ شماره ۶۶ و در موقیت مکانی باز شماره ۱۰۵ بوده است. شکل ۳- ۱۹ موقعیت مکانی این حذف نوکلئوتیدی را نشان میدهد.
شکل ۳- ۱۹ محل وقوع یک موتاسیون حذف نوکلئوتیدی در محل باز شماره ۹۸ از قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
تعداد انواع دیگر موتاسیونهای یافت شده در این قطعات در جدول ۳- ۲۱ نشان داده شده است. مطابق نتایج این جدول، تعداد کل بازهای آنالیز شده در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1 متعلق به همه ژنوتیپهای مورد مطالعه ۴۲۷۵۷ نوکلئوتید بوده است که از میان آنها ۲۱۸ نوکلئوتید دچار موتاسیون شده و این تعداد موتاسیون در ۸۳ موقعیت مکانی از این قطعه ژنی واقع شده اند. از مجموع موتاسیونهای موجود در این قطعه در کلیه ژنوتیپها صرفاً ۳ موتاسیون از نوع موتاسیون هموزیگوس در منطقه کد کننده ژن بوده اند.
جدول ۳- ۲۱ تعداد موتاسیونهای نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1
کل تعداد بازهای موتانت یافته | تعداد مکانهای ژنی حامل موتاسیون | تعداد موتاسیون هموزیگوس در منطقه کد کننده ژن | تعداد کل بازهای تجزیه شده در ۹۶ ژنوتیپ |
۲۱۸ باز | ۸۳ مکان | ۳ موتانت | ۴۲۷۵۷ باز |
۳-۹-۱-۲ نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 (که توالی نوکلئوتیدی آن در شکل ۳- ۱۸ آورده شده است) به صورت شکل ۳- ۲۰ میباشد. همان گونه که مشاهده میگردد این قطعه bp 560 یکبار توسط آنزیم های EcoRV، BamHI، HincII به ترتیب درمکانهای نوکلئوتیدی ۵، ۱۰۰ و ۲۱۴ و دوبار توسط آنزیم BstXI در مکانهای نوکلئوتیدی ۲۵۵ و ۴۴۱ باز برش داده می شود.
شکل ۳- ۲۰ نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 1
مقایسه محل هضم آنزیمی این آنزیم های برشی و مکان وقوع موتاسیونها در این قطعه ژنومی نشان داده است که از مجموع ۲۱۸ باز موتانت که در این قطعه یافت شده است، یک تغییر موتاسیونی در محل هضم آنزیم BamHI (نوکلئوتید شماره ۱۰۰) واقع شده و دیگری با فاصله یک باز در مجاورت محل برش آنزیم BstXI (نوکلئوتید شماره ۲۵۴) قرار گرفته که مشخصات آنها در جدول ۳- ۲۲ آمده است.
جدول ۳- ۲۲ مشخصات موتاسیونهای نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیم های برشی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
نام آنزیم | نوع موتاسیون | تعداد ژنوتیپهای حامل این موتاسیون |