قطعه تکثیری ژن CBL4 در کانتیگ هفتم یک محل برش برای آنزیم­ های BamHI, HindIII, PaeI, PstI, SalI, SmaI, XbaI ، دو محل برش برای آنزیم­ های SacI XmiI,، و چهار محل برش برای آنزیم HincII نشان می­دهد. بررسی موتاسیون­هایی که در این کانتیگ وجود دارند نشان داده است که هیچ یک از آن­ها در محل برش این آنزیم­ های برشی واقع نشده­اند.

تعداد ژنوتیپ­های حامل موتاسیون در محل هضم آنزیم­ های برشی در قطعه کامل توالی بیان شده ژن CBL4، ۶ ۱۵ ژنوتیپ و در قطعه کامل توالی بیان شده ژن HKT1، ۸۵ ژنوتیپ بوده است.
۳-۹ آنالیز ژن HKT1 براساس قطعات تکثیری پرایمرها
۳-۹- ۱ آنالیز قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
پرایمر HKT1-1 موجب تکثیر قطعه bp 560 از بخش ابتدایی ژن HKT1 گردیده که توالی نوکلئوتیدی این قطعه در شکل ۳- ۱۸ نشان داده شده است.
۱TCGCACTCATATATAGCACCATGGGTTGGGTGAAAAGATTTTACCAAGATTTCATCCATA
۶۱TCAAGCTGCATAGCTTTTGCCGTATCAGTAGATATGTTGTCGATTCAATAGCTTTTGTCT
۱۲۱ATCGATTTGTTGCATTGCATGTTCACCCCTTCTGGATCCAACTGTCCTACTTCCTTGCCA
۱۸۱TTGCTATACTTGGTTCAGTCCTCTTGATGTCGCTGAAACCAAGCAACCCCGACTTCAGCC
۲۴۱CTCCTTACATTGACATGTTATTCTTGTCAACTTCTGCTCTAACAGTTTCTGGCCTCAGCA
۳۰۱CCATCACGATGGAGGACCTCTCAAGCGCTCAAATTGTGGTCTTGACACTGCTCATGCTTG
۳۶۱TAGGAGGGGAGATCTTTGTTTCACTCTTAGGGCTCATGCTTAGAGTGAACCATCAAGACA
۴۲۱TGCCAGATCTTCCAAGAGTGAAGATCAGCTCAGTTCCTGTCGAGCTTGAAGAGATAGACT
۴۸۱TGGCCAACAGCATGGCACTCTCTGATGAGTCACAGCTTGAAGAAGCAACTCATGCAATTA
۵۴۱ CACCCAAGAAATGTACAGGG
شکل ۳- ۱۸ توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1
این قطعه ژنومی در کلیه ژنوتیپ­های آزمایشی با پرایمر HKT1-1 تکثیر شده و تعیین توالی گردید و سپس توالی آن­ها به کمک نرم افزار CodonCode Aligner با توالی مربوط در شاهد مقایسه شد. از طریق این مقایسه، انواع موتاسیون­های موجود بین ژنوتیپ­های مختلف مورد مطالعه و شاهد تعیین گردید. همچنین به وسیله این نرم افزار، نقشه هضم آنزیمی نیز به دست آمده است.
۳-۹-۱-۱ موتاسیون­های حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
آنالیز و مقایسه توالی نوکلئوتیدی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 در ۹۶ ژنوتیپ آزمایشی نشان داده است که فقط یک موتاسیون حذف و اضافه نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری این پرایمر مشاهده شده و شامل حذف یک تک نوکلئوتید در ژنوتیپ شماره ۶۶ و در موقیت مکانی باز شماره ۱۰۵ بوده است. شکل ۳- ۱۹ موقعیت مکانی این حذف نوکلئوتیدی را نشان می­دهد.
شکل ۳- ۱۹ محل وقوع یک موتاسیون حذف نوکلئوتیدی در محل باز شماره ۹۸ از قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
تعداد انواع دیگر موتاسیون­های یافت شده در این قطعات در جدول ۳- ۲۱ نشان داده شده است. مطابق نتایج این جدول، تعداد کل بازهای آنالیز شده در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1 متعلق به همه ژنوتیپ­های مورد مطالعه ۴۲۷۵۷ نوکلئوتید بوده است که از میان آن­ها ۲۱۸ نوکلئوتید دچار موتاسیون شده و این تعداد موتاسیون در ۸۳ موقعیت مکانی از این قطعه ژنی واقع شده ­اند. از مجموع موتاسیون­های موجود در این قطعه در کلیه ژنوتیپ­ها صرفاً ۳ موتاسیون از نوع موتاسیون هموزیگوس در منطقه کد کننده ژن بوده ­اند.
جدول ۳- ۲۱ تعداد موتاسیون­های نوکلئوتیدی در قطعات تکثیری پرایمر HKT1-1

۳-۹-۱-۲ نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1
نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1 (که توالی نوکلئوتیدی آن در شکل ۳- ۱۸ آورده شده است) به صورت شکل ۳- ۲۰ می­باشد. همان گونه که مشاهده می­گردد این قطعه bp 560 یکبار توسط آنزیم­ های EcoRV، BamHI، HincII به ترتیب درمکان­های نوکلئوتیدی ۵، ۱۰۰ و ۲۱۴ و دوبار توسط آنزیم BstXI در مکان­های نوکلئوتیدی ۲۵۵ و ۴۴۱ باز برش داده می­ شود.

شکل ۳- ۲۰ نقشه هضم آنزیمی قطعه تکثیری پرایمر HKT1- 1
مقایسه محل هضم آنزیمی این آنزیم­ های برشی و مکان وقوع موتاسیون­ها در این قطعه ژنومی نشان داده است که از مجموع ۲۱۸ باز موتانت که در این قطعه یافت شده است، یک تغییر موتاسیونی در محل هضم آنزیم­ BamHI (نوکلئوتید شماره ۱۰۰) واقع شده و دیگری با فاصله یک باز در مجاورت محل برش آنزیم BstXI (نوکلئوتید شماره ۲۵۴) قرار گرفته که مشخصات آن­ها در جدول ۳- ۲۲ آمده است.
جدول ۳- ۲۲ مشخصات موتاسیون­های نوکلئوتیدی در محل هضم آنزیم­ های برشی قطعه تکثیری پرایمر HKT1-1