پس از سرد شدن محصول در دمای اتاق، ۲۰ میلیلیتر از مالاشیت گرین اتوکلاو شده و تازه تهیه شده به آن اضافه گردید.
برای تهیه این محیط از تخم مرغهای تازهای که بیشتر از یک هفته از عمر آن نگذشته بود، استفاده گردید. ابتدا با یک برس و یک محلول صابونی ۵ درصد روی پوسته تخم مرغ ها کاملا” سائیده شد تا تمیز گردند، سپس تخم مرغها در محلول صابونی ۵ درصد به مدت ۳۰ دقیقه غوطه ور گردیدند. بعد از شستشو با آب، از اتانول ۷۰ درصد برروی تخم مرغها اسپری گردید و به مدت ۱۵ دقیقه تخم مرغها در این وضعیت قرار گرفتند. بعد از شستشو و ضد عفونی کردن دستها با الکل ۷۰ درصد محتویات تخم مرغ را یکی یکی داخل فلاسک استریل شکسته و با تکانهای دست یکنواخت و هموژنیزه شدند. تخم مرغهای هموژنیزه را با یک گاز ۴ لایه استریل فیلتر کرده و داخل یک ارلن استریل ریخته شد سپس ۱۰۰۰ میلیلیتر از تخم مرغ به محلول تهیه شده اضافه گردید.
مخلوط حاصل با دست تکان داده شد و برای اختلاط کامل، از دستگاه همزن استفاده گردید.
در شرایط استریل مقدار ۶ الی ۸ میلیلیتر از محیط کشت در لولههای آزمایش در پیچدار ریخته شد و محیطها در دستگاه پخت محیط یا کواگولاتور بصورت Slant (شیب دار و مایل) قرار گرفتند تا به مدت ۵۰ دقیقه در دمای ۸۵ درجه سانتی گراد پخته شوند.
محیطهای آماده و پخته شده به مدت ۴۸ ساعت با در نیمه باز (شل) جهت کنترل در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفت، در صورت عدم آلودگی درب لولهها محکم گردید.
۳-۲-۳. آلودگیزدایی و تغلیظ نمونهها
برای آلودگیزدایی نمونهها از روش N - استیل-L - سیستئین – هیدروکسید سدیم (NaOH-NALC) استفاده گردید.
اصولا هیدروکسید سدیم، یک ماده آلودگیزدای شدیدا سمی میباشد، که بعنوان یک امولسیون کننده هم عمل می کند. افزودن ماده موکولیتیک N - استیل-L - سیستئین (NALC) ، غلضت هیدروکسید سدیم را کاهش داده و زمان لازم برای عمل آلودگیزدایی را کوتاه می کند. بنابراین در به دست آوردن اکثر، باسیل مقاوم به اسید کمک می کند .(Forbes B.A and Hicks K., 1993)
مواد مورد نیاز
محلولهای سیترات سدیم (۹/۲ % یا ۱/۰ نرمال)
سود (۴% یا ۱ نرمال)
بافر فسفات ۰۶۸/۰ مولار با ۸/۶ pH= : که مخلوطی به میزان مساوی از محلولهای Na2HPO4 و KH2PO4 است.
محلول NaOH-NALC : که مخلوطی از سیترات سدیم، سود و NALC است که تازه استفاده می شود.
۳-۲-۳-۱. آماده سازی محلولها
تهیه سیترات سدیم ۹/۲ درصد (۱/۰ مولار)
۴/۲۹ گرم سیترات سدیم بدون آب به یک لیتر آب مقطر استریل اضافه شد و ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد اتوکلاو گردید.
تهیه سدیم هیدروکسید ۴ درصد (یک نرمال)
۴۰ گرم سود در مقدار کمی آب مقطر حل شد، حجم نهایی به ۱ لیتر رسید.
در مرحله بعد ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد اتوکلاو گردید.
در صورت مشاهده هر نوع کدورت و اشکال تودهای، محلول غیر قابل استفاده خواهد بود.
بافر فسفات ۰۶۷/۰ مولار pH=6/8
استوک قلیایی: برای تهیه دی سدیم فسفات ۱۵ مولار (Na2HPO4) در یک فلاسک مدرج ۴۷/۹ گرم Na2HPO4 بدون آب اضافه شد سپس با کمی آب مقطر حل گردید و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسید.
استوک اسیدی: برای تهیه مونو پتاسیم فسفات ۱۵ مولار (KH2PO4) در یک فلاسک مدرج ۰۷/۹ گرم KH2PO4 اضافه شد سپس با کمی آب مقطر حل گشته و بعد از انحلال کامل، حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسید.
به میزان مساوی از هر دو استوک با یکدیگر مخلوط شد و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد بمدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید.
۳-۲-۴. روش کار کشت
در یک لوله سانتریفوژ ۵۰ میلیلیتری یک حجم از محلول NaOH-NALC به حجم مساوی از نمونه اضافه گردید.
در مرحله بعد لولهها توسط ورتکس مخلوط شد (زمان اختلاط نباید از ۳۰ ثانیه بیشتر میشد زیرا NALC در حضور اکسیژن ناپایدار بوده و فعالیت خود را از دست میداد).
لولهها جهت عمل دکانتامیناسیون (۲۰ الی ۲۵ درجه سانتی گراد) به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند.
پس از سپری شدن زمان مذکور، مخلوط با آب مقطر استریل یا بافر فسفات به حجم نهایی ۵۰ میلی لیتر رسید (با این رقیق سازی، عمل NaOH متوقف شده و از چسبندگی و ویسکوزیته مخلوط کاسته می شود).
در لولهها محکم بسته شد، چند بار وارونه گردید تا محتویات داخل لولهها کاملا” مخلوط و یکنواخت گردند.
لولهها در rpm 3000 به مدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه سانتریفوژ شدند.
مایع رویی به یک ظرف محتوی محلول آلودهزدا حاوی یک ماده ضدعفونی کننده نظیر فنل ۵ درصد منتقل گردید.
به رسوب حاصل، بافر فسفات اضافه شد و توسط پیپت پاستور استریل قسمتی از رسوب را برداشته به محیط کشت انتقال داده شد.
باقیمانده رسوب را روی لام برده، یک گسترش به طول ۱ تا ۲ سانتیمتر ایجاد گردید.
نمونهها در ۴ لوله حاوی محیط لونشتاین جانسن دارای گلیسرول و لونشتاین جانسن بدون گلیسرول دارای پیرووات کشت داده شد. (۲ لوله قبل از عمل دکانتامینه و ۲ لوله بعد از عمل دکانتامینه) درب لولهها را نیم پیچ باز گذاشته سپس لولهها را در انکوباتور۳۷ درجه قرار داده بعد از دو هفته درب لولهها را سفت کرده و به مدت ۲ ماه در ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری کرده و هر هفته لولهها بررسی شدند.
۳-۲-۴-۱. محیط کشت حاوی تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرازید
این محیط کشت جهت افتراق M. bovis ازM. tuberculosis میباشد، که M. bovis قادر به رشد در این محیط نمی باشد.
۵/۲ گرم از پودر تیوفن ۲- کربوکسیلیک اسید هیدرارید به ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر اضافه شد و غلظت ۵/۲% آن تهیه گردید و ۲۰۰ میکرولیتر از استوک ۵/۲% به ۲۰۰ میلیلیتر از محیط کشت اضافه شد و غلظت آن در محیط کشت به ۵/۲ میکروگرم بر میلیلیتر رسید.
۳-۳. تشخیص میکروسکوپی مایکوباکتریومها
۳-۳-۱. تهیه گستره
از رسوب مایعات استریل بدن، قبل و بعد از یکنواختی و آلودگیزدایی ابتدا گستره میکروسکوپی تهیه شد بنحوی که یک اسمیر (گسترش)، با پخش کردن حدود ۱/۰ سیسی از نمونه مورد نظر بر روی منطقهای با ابعاد تقریبی ۱×۲ سانتیمتر از یک اسلاید (لام) شیشه ای نو، تمیز و برچسب خورده میکروسکوپی در هنگام کشت تهیه گردید. گستره تهیه شده پس از خشک شدن در هوای آزمایشگاه به وسیله حرارت (۸۵ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه) ثابت شد.
سپس با روش فلورئوکروم اورامین _ رودامین رنگآمیزی شد و به وسیله میکروسکوپ فلورسانس با ابژکتیو پایین و خشک مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۳-۲. رنگآمیزی اسید-فست فلورسنس اورامین O
مواد مصرفی: اورامین O ،اتانول ۹۵ درصد، فنل کریستال، اسید کلریدریک غلیظ، رد تیازین، آب مقطر
آماده سازی مواد
اورامین O : 1/0 گرم از اورامین O در ۱۰ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد حل گردید.
فنل: ۳ گرم فنل کریستال در ۸۷ میلیلیتر آب مقطر حل شد.
دو محلول بالا با هم مخلوط شدند.
اسید الکل: با دقت ۵/۰ میلیلیتر اسید هیدروکلراید غلیظ را به ۱۰۰ میلیلیتر اتانول ۷۰ درصد افزوده سپس به آرامی مخلوط گردیدند.
رد تیازین: ۱ گرم رد تیازین همرا با ۵۰ میلی لیتر فنل و ۱۰۰ میلیلیتر اتانول در ۸۵۰ میلیلیتر آب مقطر حل شد.
مراحل رنگآمیزی
سطح اسیمر از محلول اورامین لبریز گردید و اجازه داده شد تا ۱۵ دقیقه رنگ با گسترش تماس داشته باشد.
لام با آب مقطر شسته شد سپس در ظرف اسید الکل به مدت ۲-۳ دقیقه قرار داده شد تا کاملا” رنگ بری صورت گیرد.
مجددا” اسمیر شسته و خشک گردید.
بررسی مقایسه ای پروفایل پروتئینی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس- فایل ۱۸
