معادله۳- ۶

معادله۳-۷

معادله۳-۸

معادله۳-۹

۳-۴-۵- اندازه ­گیری سدیم و پتاسیم و فسفر قابل جذب توسط گیاه
الف- سدیم و پتاسیم

1. 1. عصاره­گیری

نمونه­های برگ، ریشه و ساقه در آون با دمای ۴۰۰ درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۴ ساعت خشک شدند پس از آن از هر اندام به اندازه ۱/۰ گرم وزن شدند (نمونه­هایی با وزن کمتر از ۱/۰ گرم یادداشت شدند) و در بوته­ های چینی در کوره با دمای ۵۰۰ درجه سانتی ­گراد به مدت ۴ ساعت قرار داده شدند. بعد از گذشت مدت زمان لازم نمونه­های پودر شده با ۱ میلی لیتر اسیدکلریدریک ۱ نرمال و ۹ میلی­لیتر آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰ سی­سی رسانده شده سپس با بهره گرفتن از کاغذ صافی عصاره مورد نظر صاف شد.

1. 1. اندازه ­گیری

اندازه ­گیری سدیم و پتاسیم قابل جذب هر یک از اندام­های برگ، ریشه و ساقه توسط دستگاه فلم­فتومتری انجام گرفت، قبل از قرائت مقادیر نمونه­ها مقادیر سدیم و پتاسیم استانداردها توسط دستگاه فلم­فتو­متری قرائت شد که با داشتن اعداد به­دست آمده یک منحنی استاندارد (مرجع) رسم شد و سپس سدیم و پتاسیم نمونه­ها قرائت شد که با تطبیق دادن با منحنی استاندارد غلظت سدیم و پتاسیم هر یک از اندام­های برگ، ریشه و ساقه بر حسب ppm به­دست آمد در نهایت مقدار سدیم و پتاسیم از طریق رابطه زیر بر حسب میلی­گرم بر گرم به­دست آمد:
معادله ۳-۱۱ X=C×۱۰/M×۱۰۰۰
X= مقدار سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه بر حسب میلی­گرم بر گرم
C= مقدار سدیم و پتاسیم قابل جذب توسط گیاه به میلی­گرم بر لیتر (ppm)
۱۰= حجم هر نمونه (عصاره)
M= وزن هر نمونه
ب- فسفر
۱- عصاره­گیری
با همان روش عصاره­گیری سدیم و پتاسیم صورت گرفت.
۲-تهیه استوک فسفر (یک مولار)
میزان ۲۱۹۵/۰ KH₂PO₄ وزن گردید و با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد و سپس برای تهیه استاندارد استوک به نسبت ۱:۵۰ رقیق گردید.

۳-تهیه معرف A
۵/۲۲گرم آمونیوم مولیبدات وزن گردید و ۴۰۰ میلی­لیتر آب دو بار تقطیر به آن اضافه شد.
۴-تهیه معرف B
معرف B در همان روزی که استفاده می­ شود باید تهیه شود و تهیه آن به این صورت است که ۲۵/۱ گرم آمونیوم وانادیات وزن شد و سپس ۳۰۰ میلی­لیتر آب دوبار تقطیر اضافه شد و گرم می­ شود تا به خوبی حل گردد.
۵-تهیه معرف اصلی
معرف A با معرف B مخلوط و به حجم یک لیتر رسانده می­ شود تا به دمای اتاق برسد. سپس ۲۵۰ میلی­لیتر اسید نیتریک یک نرمال به محلول اضافه می­کنیم.
۶-روش اندازه ­گیری فسفر
یک میلی­لیتر از نمونه در استوانه مدرج ریخته می­ شود و ۵ میلی لیتر از معرف اصلی فسفر به آن اضافه گردید و سپس با آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰ رسانده شد و عصاره تهیه شده کمی به هم زده شد تا نهایتا بعد از نیم ساعت به رنگ زرد در آید. برای اندازه ­گیری میزان فسفر هر یک از اندام­ها باید قبل از شروع استاندارد­های ۰ ،۵ ،۱۰، ۱۵، ۲۰، ۲۵ را با دستگاه اسپکتوفتومتر با طول موج۴۷۰ (نانو­متر) در حالت انتقال (Trans) قرائت گردید که با داشتن اعداد به­دست آمده یک منحنی استاندارد (مرجع) رسم شد و سپس عدد عصاره نمونه­ها قرائت شد و با تطبیق دادن با منحنی استاندارد غلظت فسفر بر اساسppm مشخص شد. سپس با بهره گرفتن از معادله ۳-۱۱ به میلی­گرم در گرم تبدیل شد.
۳-۵- مطالعات مولکولی
۳-۵-۱- استخراج (RNA)
جهت استخراج RNA باید از قبل تمام وسایل مورد نیاز جهت انجام عمل استخراج اتو­کلاو شده باشند و تا جایی که امکان دارد از برخورد مستقیم دست با وسایل خودداری شود و در حین کار از دستکش استفاده شود. نمونه­های برگ و ریشه در روز برداشت از نمونه­ها جمع­آوری شدند و در دمای c°۴۰- نگهداری شدند. برای استخراج RNA در دو روز پی­در پی عمل استخراج انجام شد.
۳-۶-۱روز اول
۱۰۰ تا ۲۰۰ میلی­گرم از نمونه­ها را همراه با ازت مایع در هاون چینی کوبیده و در میکروتیوپ­های ۵/۱ میلی­لیتری ریخته شدند (میکروتیوپ­ها باید درون ازت مایع قرار بگیرند). بعد از مرحله کوبیدن نمونه­ها ۱ میلی­لیتر از بافر استخراج به نمونه­های کوبیده شده اضافه گردید و درون بن ماری با دمای ۶۵ به مدت ۵ دقیقه قرار داده شد و هر ۲ دقیقه یکبار نمونه­ها از بن­ماری بیرون آورده و ورتکس شدند. پس از آن ۲۰ میکرولیتر مرکاپتواتانول به نمونه­ها اضافه و به مدت ۱۵ ثانیه ورتکس شدند. سپس مجددا نمونه­ها به مدت ۱۰ دقیقه در بن­­ماری با دمای ۶۵ درجه قرار گرفتند و هر ۳ دقیقه یکبار با دست ورتکس شدند. پس از اینکه نمونه­ها از بن­ماری بیرون آورده شدند به اندازه ۱ واحد از حجم نمونه­ها کلروفورم ایزوآمیل­الکل به نمونه­ها اضافه شدند (کلروفورم ایزوآمیل­الکل به نسبت ۱:۲۴ تهیه شد). سپس نمونه­ها توسط سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای اتاق (۲۵ درجه سانتی ­گراد) به مدت ۱۰ دقیقه مخلوط شدند و در نهایت مایع رویی به میکروتیوپ جدید منتقل شد. مجدداً ۱ واحد کلروفورم­ ایزوآمیل ­الکل اضافه شد و توسط ورتکس مخلوط شدند. بعد از این مرحله نمونه­ها درون سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه و دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند. مجددا مایع رویی به تیوپ جدید منتقل شد و پس از آن به اندازه یک چهارم حجم مایع رویی لیتم کلراید سرد (۱۰مولار) (از قبل در دمای ۴- درجه قرار داده شدند) اضافه کرده و نهایتا ورتکس شدند و در دمای ۴- درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ شب قرار گرفتند.
۳-۶-۲ روز دوم
نمونه­های آماده شده از روز قبل را که درون یخچال بودند، درون سانتریفیوژ با ۹۰۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۰ دقیقه قرارگرفتند. در این مرحله لکهRNA ته میکروتیوب می­چسبد و مایع رویی دور ریخته می­ شود و میکروتیوپ­ها را به صورت وارونه قرار می­دهیم تا پلتی که ته میکروتیوپ هست، کاملا خشک شود. پس از آن ۵۰۰ میکرو لیتر بافر STE (بدون SDD) به پلت اضافه شد و در بن­ماری با دمای ۶۵ درجه سانتی ­گراد قرار می­دهیم و هر چند دقیقه یکبار با دست تکان داده شد تا پلت در محلول بافر خوب حل شود. در مرحله­ بعد ۴۵۰ میکرو­لیتر کلروفورم ایزوآمیل الکل به میکروتیوپ حاوی پلت و بافر STE اضافه و نهایتا ورتکس شدند. سپس نمونه­ها در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۵ دقیقه قرار می­دهیم. بعد از آن مایع رویی را به میکروتیوپ جدید منتقل شد (تیوپ­ها در ظرف یخ قرار گیرند). پس از آن که مایع رویی به میکروتیوپ جدید منتقل شد، ۱۵۰ میکرولیتر بافر STE مجددا به مایع درون میکروتیوپ اضافه و ورتکس شد. مجدداً در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه و دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده شد، سپس مایع رویی وارد میکروتیوپ جدید شد. پس از آن ۶۰۰ میکرو­لیتر استات سدیم ۳ مولار به محتوای تیوپ اضافه کرده و ۵/۲ برابر حجم آن اتانول ۱۰۰% (از قبل در دمای ۲۰- درجه گذاشته شود) اضافه شد و نهایتا ورتکس شد و به مدت ۲ ساعت در یخچال ۲۰- درجه قرارگرفتند. بعد از آنکه نمونه­ها از یخچال بیرون آورده شدند و در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۰ دقیقه قرار گرفتند. پس از آن مایع رویی دور ریخته شد و میکروتیوپ به حالت وارونه قرار گرفتند تا پلتی که ته میکروتیوپ چسبیده بود کاملا خشک شود. در مرحله­ بعد ۴۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰% (از قبل در دمای ۲۰- درجه­سانتی گراد گذاشته شود) اضافه می­کنیم و ورتکس می­ شود. در نهایت نمونه­ها در سانتریفیوژ با ۹۵۰۰ دور در دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند، بعد از آن مایع رویی دور ریخته شد و پلت خشک شد، سپس ۳۰ میکرولیتر آب دبس به هر نمونه اضافه شد.
۳-۵-۲-تهیه ژل آگارز (یک درصد)
۵/۱ گرم آگارز توزین و با ۷۲ میلی­لیتر آب دوبار تقطیر مخلوط و در ماکروویو به مدت یک دقیقه قرار داده شد تا حل گردد. بعد از حل شدن ژل، به مدت چند ثانیه ظرف حاوی ژل را زیر هود قرار گرفت تا سرد شود (دما به ۵۵ درجه سانتی ­گراد برسد). پس از آن ۱۰ میلی­لیتر بافر موپس ] X10[ به آرامی به ژل اضافه کرده و بعد از آن ۱۸ میلی­لیتر فرمالدهید اضافه کرده و در نهایت ۵ میکرولیتر اتیدیوم بروماید اضافه و با آب دبس به حجم ۱۰۰میلی­لیتررسانده شد.