۲-۶- فعالیت ضدمیکروبی

۲-۶-۱- روش انتشار در آگار (دیسک دیفیوژن)

تعیین فعالیت­های ضدمیکروبی عصاره­های گیاهی با روش انتشار در آگار )۱۹۹۷، NCCLS) انجام شد. عصاره خشک گیاه در DMSO با غلظت نهایی ۳۰ میلی گرم بر میلی لیتر حل شده و با فیلتر میلی‌پور ۴۵/۰ میکرومتراستریل شد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون حاوی ml/CFU 10⁸ از باکتری ها، CFU/ml 10⁶ از مخمر و spore/ml10⁴ بر روی محیط‌های کشت نوترینت آگار، سابرو دکستروز و پوتیتو دکستروز آگار اسپری شد. دیسک (با قطر۶ میلیمتر) با ۱۰ میکرولیتر از محلول­هایی از عصاره‌ها آغشته شده (g/discµ۳۰۰) و DMSO (به عنوان کنترل منفی) در آگار تلقیح شده قرار داده شد. صفحات آغشته شده به مدت ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد برای سویه‌های باکتریایی و در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت برای سویه­های مخمر و کپک به صورت جدا در انکوباتور بودند. بر روی هر دیسک ۱۰ میکروگرم از جنتامیسین و ۵ میکروگرم از ریفامپین برای باکتری‌ها و I.U.100 نیستاتین برای قارچ به عنوان گروه کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت. قطرهاله مهار با بهره گرفتن از خط‌کش آنتی‌بیوگرام اندازه‌گیری شد و به عنوان معیاری برای فعالیت ضد میکروبی مورد استفاده قرار گرفت. در هر مورد دیسک‌گذاری دو بار تکرار شد.

۲-۶-۲- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد

در این روش حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) برای میکروارگانیسم­های حساس به عصاره­های گیاهی با روش رقت‌سازی در محیط کشت مایع محاسبه گردید. برای این منظور صفحه­های ۹۶ خانه­ای استریل تهیه شد. به هر یک از خانه­ها ۹۵ میکرولیتر محیط کشت مایع BHI، ۵ میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی با رقت ۵/۰ مک فارلند و ۱۰۰ میکرولیتر از غلظت­های مختلف عصاره (۵۰۰-۸/۷ میکرو گرم بر میلی لیتر) افزوده شد و سپس در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت گذاشته شد. رشد میکروبی با حضور کدورت در ته‌چاهک مشخص می­ شود. مقدار MIC کمترین غلظت عصاره مورد نیاز برای مهار رشد هر میکروارگانیسم تعریف می‌شود.

۲-۷- آزمون سمیت سلولی

تخم‌های آرتمیا سالینا (Artemia salina)، برای باز شدن در آب شور مصنوعی دریا در آکواریوم تحت نور و هوادهی مداوم و دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد بن ماری، برای ۴۸ ساعت قرار داده شدند. آب شورمصنوعی از انحلال نمک‌های زیر در ۲ لیتر آب مقطر حاصل شد.

2. 2. g) 22) H₂O6MgCl₂.، (g 8 ) Na₂SO₄، g)6/2) H₂O2CaCl₂.، g)4/1)KCl، (g46)NaCl

pH آب شور برابر ۹ تنظیم شد که در صورت کم بودن pH از سدیم کربنات برای بالا بردن آن استفاده می‌شود. لاروهای با بهره گرفتن از ویژگی فوتوتروپی از پوسته‌ها و تخمهای تفریخ نشده جدا شدند. مقدار ۰۵/۰ گرم از عصاره در ۸/۰ میلی‌لیتر DMSO حل شده و با آب شور به حجم ۲۵ رسید. برای اطمینان از خنثی بودن اثر حلال بر روی لاروها، شاهد DMSO هم مورد آزمایش قرار گرفت. به هر لوله آزمایش ۱۰ لارو آرتمیا اضافه شد (برای جدا کردن‌لاروها از پیپت پاستور استفاده شد) و رقت­هایی از محلول‌های استوک ‌نمونه­های گیاهی (۱۰، ۳۰۰، ۵۰۰، ۷۰۰، ۱۰۰۰ میکروگرم بر میلی لیتر) در لوله­های آزمایش تهیه نموده و حجم آنها با آب دریا به ۵ میلی لیتر رسید. در لوله­های آزمایش کنترل منفی آب دریا و حلال DMSO به تنهایی اضافه شد. و لوله‌های آزمایش در بن‌ماری با دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد قرار گرفت بعد از ۲۴ ساعت تعداد لاروهای مرده در لوله آزمایش بررسی شد. از روی شمارش لاروهای مرده درصد مرگ‌ومیر و نمودار غلظت-درصدکشندگی حاصل می‌شود و ^[۵۵] LC₅₀ (غلظتی که درصد کشندگی ۵۰ را دارد) قابل محاسبه است.
فصل سوم
نتایج، بحث و نتیجه ­گیری
مقدمه
پس از آماده‌سازی گیاه جمع آوری شده از مناطق اطراف بروجن، با دستگاه SDE ترکیبات فرار آن و با سوکسله عصاره غیرفرار استخراج شد که نتایج مربوط در جدول‌های ۳-۱ و ۳-۴ گزارش شده است. سپس تجزیه و تحلیل ترکیبات فرار استخراجی با بهره گرفتن از دستگاه کروماتوگرافی گازی-طیف نگار جرمی، محاسبه زمان بازداری کواتس در طیف GC-MS و مقایسه طیف‌های جرمی نمونه با طیف‌های جرمی استاندارد صورت گرفت و ترکیب‌های فرار مشخص گردید. در ادامه کار، اثرات ضد اکسیدانی، ضدمیکروبی، محتوای تام فنلی و سمیت سلولی با استفاده روش‌های مشروح در فصل دوم ارزیابی شد و نتایج در این فصل گزارش شده است.

۳-۱- ترکیبات ‌فرار گیاهی

۳-۱-۱- استخراج ترکیبات ‌فرار گیاهی

در این پژوهش استخراج اسانس از گیاهان مذکور با دستگاه SDE در حضور حلال آلی انجام گرفت . نتایج و بازده اسانس گیری در جدول ذیل نشان داده شده است.
جدول ۳-۱: مقایسه بازده استخراج ترکیبات فرار