امروزه برای برآورد هتروزیس،قابلیت ترکیب پذیری و حتی اجزای واریانس ژنتیکی افزایشی، غالبیت و اپیستازی، می توان از انواع طرحهای آمیزشی سودجست ( فرشاد فر،۱۳۷۷). در این طرحها انواع مختلف خویشاوندان به وجود می آیند.با به کارگیری این طرحهای آمیزشی و روش های آماری مناسب می توان اجزای واریانس را محاسبه نمود. طرحهای زیادی برای برآورد واریانسهای ژنتیکی پیشنهاد شده است :

1. 1. طرحهای آمیزشی ناقص نظیر آزاد گرده افشانی و پلی کراس که در آنها واریانس ژنتیکی و GCA قابل برآورد است اما امکان برآورد SCA و واریانس غیر افزایشی به دلیل عدم شناسایی والد برتر از نتاج فراهم نیست.

1. 1. طرح های آشیانه ای که در آنها گروههایی از والدین به عنوان والد پدری با گروههایی به عنوان والد مادری آمیزش می یابند. استفاده از این طرح به اصلاح کنندگان اجازه می دهد تا واریانس های افزایشی و غالبیت را برآورد کنداین طرحها به طرحهای کارولینای شمالی معروف است.

1. 1. طرح آمیزش فاکتوریل که در آن گروه والد پدری با اعضای والد مادری در تمام حالات ممکن تلاقی داده می شوند. در این طرح تعدادی از والدین به عنوان تستر با والدین دیگر در جمعیت مورد آزمون تلاقی می یابند. با بهره گرفتن از این طرح قابلیت ترکیب پذیری و اجزای واریانس قابل برآورد است.

1. 1. معمول ترین روش طرح تلاقی دی آلل است که به طور گسترده توسط محققین استفاده می شود.

روش تلاقی دی آلل
هدف نهایی اکثر برنامه های به نژادی،افزایش تولید ازطریق بهبود ژنتیکی است.یکی از روش های تجزیه ژنتیکی که می تواند نحوه کنترل صفات مهم زراعی به خصوص صفات کمی را روشن سازد تجزیه تلاقی دای آلل می باشد.در این روش با بهره گرفتن از آماره های درجه دو مانند واریانس والدین،واریانس و کواریانس والدین می توان اجزای واریانس را برآورد نمود.علاوه بر این نتاج و اطلاعات به دست آمده از این روش می تواند برای پیش بینی عملکرد هیبرید های حاصل از والدین مختلف به کار رود.برتری این روش نسبت به روش های دیگر ژنتیک کمی این است که می توان در مدت کو تاهی به پرسشهایی از جمله نحوه کنترل صفت یعنی تعداد ژنهای کنترل کننده صفت،اثرات متقابل ژنی و اپیستازی در تظاهر صفت پاسخ دهد.علاوه بر این،کاربرد روش دای آلل در اصلاح نباتات می تواند در گزینش بهترین ترکیب شونده ها و تخمین هتروزیس در تولید هیبرید ها مورد استفاده قرار بگیرد. با بهره گرفتن از تجزیه دای آلل می توان ماهیت و تعداد پارامترهای ژنتیکی و ترکیب پذیری عمومی و خصوصی والدین و نتایج حاصل از آنها را تخمین زد. اصطلاح دای آلل در سال ۱۹۱۹ توسط اشمیت برای طرح فاکتوریل که در آن دو ژنوتیپ ماده در کلیه جهات ممکن با دو ژنوتیپ نر تلاقی می یابند پیشنهاد شد. امروزه اصطلاح دای آلل در موردی به کار می رود که در آن یک گروه n والدی در تمام جهات ممکن با هم آمیزش کنند و والدین هم به عنوان نر و هم به عنوان ماده به کار روند.دی آلل در اصل برای مطالعه صفات دیپلوئید است لذا کلمه دی آلل به معنی دو آللی است. اگر nژنوتیپ هموزیگوت در تمام جهات ممکن با هم آمیزش داده شوند مجموعه ای از تلاقی ها به وجود می آیند که اصطلاحاً تلاقی آلل نامیده می شود.تجزیه چنین تلاقی هایی را تجزیه دای آلل می گویند (فرشاد فر،۱۳۷۷).
گریفینگ در سال ۱۹۵۶ مدل دی آلل را به منظور بررسی عمل ژنهای کنترل کننده صفات کمی توسعه داد. وی بر اساس وجود یا عدم وجود والدین و تلاقی های معکوس در یک مجموعه دای آلل و نیز ثابت یا تصادفی بودن اثرات لاینها و بلوک ها روش های تجزیه آماری متفاوتی ارائه نموده است. در روش گریفینگ می توان واریانس ترکیب پذیری عمومی و خصوصی را بدست آورد. هر قدر واریانس ترکیب پذیری عمومی نسبت به ترکیب پذیری خصوصی بیشتر باشد نشان می دهد که صفت مربوطه بیشتر توسط عمل افزایشی ژنها کنترل می شود و هر قدر این نسبت کمتر باشد دلالت بر عمل غالبیت ژنها دارد . همچنین اثرات مادری و سیتوپلاسمی از طریق محاسبه d = x_ij-x_ji و آزمون (t=d/sd) در این روش قابل بررسی است. اگر در این آزمون مقدار t معنی دار شود، اختلاف بین تلاقی های اصلی و معکوس و همچنین دخالت وراثت سیتوپلاسمی تائید خواهد شد .علاوه بر این با مقایسه هیبرید های F₁ با والدین می توان اثر هتروزیس را بررسی کرد.در مدل گریفینگ با بهره گرفتن از مدل های آماری مناسب اجزا ء واریانس مربوط به ترکیب پذیری خصوصی و عمومی برآورد شده و سپس این واریانس ها با توجه به مفروضاتی به واریانس افزایشی و واریانس غالبیت تبدیل می شوند.علاوه بر این در این روش براساس مواردی که در تجزیه شرکت می کنند چهار روش مقایسه ارائه شده است.
۱-والدین ،F₁ ها و تلاقی های معکوس
۲- والدین و F₁ ها
۳-F₁ ها و تلاقی معکوس
۴-فقط F₁ ها
در این روش ها ارزش ژنتیکی والدین بر حسب قابلیت ترکیب بیان می شود.لازم به ذکر است که بین دو مفهوم وراثت پذیری و ترکیب پذیری تفاوت وجود دارد یعنی ممکن است صفتی به خوبی منتقل شود یعنی وراثت پذیری بالایی داشته باشد اما با قرار گرفتن در کنار سایر آللها وضعیت خوبی نداشته باشد.
یکی دیگر از روش های تخمین ترکیب پذیری که از گیاهان مورد استفاده قرار می گیردروش پلی کراس است . در این روش تعدادی بوته از لاین های مورد آزمایش با هم کشت شده و گرده افشانی طبیعی بین آنها انجام می شود. ازخود گشنی بوته ها با کمک مکانیسم های طبیعی یا مصنوعی ممانعت به عمل می آید . ارزیابی بذور به دست آمده که مخلوطی تصادفی از آمیزش با سایر لاینها است در نسل بعد می تواند بیانگر GCA لاین مربوطه باشد (فرشاد فر،۱۳۷۷).
کوشش هایی برای ارتباط دادن اثرات GCA و SCA با میانگین نتاج هر والد و عملکرد هیبرید ها انجام شده است. در گوجه فرنگی همبستگی بالایی بین میانگین نتاج دو والد و اثرات GCA و نیز عملکرد هیبرید ها و اثرات SCA برای برخی از صفات کمی مشاهده شده است. این موضوع نشان می دهد که والدین با قابلیت ترکیب مناسب را می توان بر مبنای میانگین نتاج والدین انتخاب کرد .به نظر می رسد که گزینش هیبرید ها بر مبنای عملکرد خود آنها قابل اطمینان تر از گزینش بر مبنای اثرات SCA باشد. بررسی ها وجود ارتباط نزدیک میان نتاج والد و GCA ، و عملکرد هیبرید ها و SCA را تایید کرده است (کالو ،۱۳۸۰).
در رابطه با نحوه کنترل ژنتیکی صفات (پهلوانی و همکاران ۱۳۸۳،کوتجا، ۱۹۸۱) با استفاده ار تجزیه میانگین نسل ها نشان دادند که اثرات افزایشی و غالبیت در کنترل عملکرد دانه نقش دارند و میزان هتروزیس نسبت به والد برتر را ۲/۸ تا ۱۲۱ درصد در تلاقی های مختلف گزارش کردند.
(سانیتاو همکاران ۲۰۱۳) در بررسی ژرم پلاسم گلرنگ گزارش کردند، که اثرات افزایشی و غیر افزایشی توماً در کنترل صفات گلرنگ نقش دارند.
فصل سوم
مواد و روش
تهیه مواد گیاهی
در این تحقیق از ۱۰ ژنوتیپ گلرنگ زراعی ، Saffire، PI-537598، Quiriego-88، PI-250537 ، Leasf ، S-555 ، IL-111 ،S-541 ، Hartman ، و توده محلی داراب ۷ ، حاصل از مطالعات قبلی استفاده شد که در مطالعات مولکولی و مزرعه ای به ترتیب با نماد های P₁ تا P₁₀مشخص شده است.
آزمایشات مزرعه ای و انجام تلاقی ها
۱۰ ژنوتیپ انتخاب شده هر کدام در یک خط جهت انجام تلاقی ها در مزرعه دانشکده کشاورزی شیروان در اوایل اردیبهشت ۹۲ کشت شدند.اخته کردن در گلرنگ موقعی انجام شد که چند گل از غوزه خارج شده بود. برای انجام تلاقی ابتدا برگچه های دور غوزه (براکته ها ) با قیچی حذف شدند تا گلچه هانمایان شوند.گلچه های باز شده را از بیخ با انبرک (پنس مخصوص) کاملاً حذف و بقیه تنک شدند به طوری که۱۵-۱۰ گلچه باقی ماند. سپس با نوک انبرک بر قسمت گردن گلچه فشار وارد کرده و آن را کج نموده تا بشکند و نوک آن را با انبرک کشیده و حذف کرده تا کلاله و خامه نمایان شود.گل های اخته شده و گل های پدری را توسط کیسه های پارچه ای، کاغذی یا آلومینیومی پوشانده شد. روز بعد وقتی که خامه طویلشد، گل های اخته شده توسط گرده گل یا غوزه والد پدری مورد نظر بارور شدند و دوباره با کیسه پوشانده شدند.توجه شود که اخته کردن و انجام تلاقی در هوای گرم انجام نشود که موجب از بین رفتن دانه های گرده و بارور نشدن مادگی خواهد شد.این روش فوق العاده وقت گیر و دشوار است طوریکه یک تکنسین مجرب قادر به اخته کردن ۱۵-۱۰ غوزه در روز خواهد بود.در این روش در هر غوزه تنها ۱۵ گلچه اخته شدند (یزدی صمدی و عبد-میشاهی ،۱۳۷۵و نولز، ۱۹۸۹) .هیبرید های حاصل به همراه والدین در غالب طرح بلوک کامل تصادفی با ۳ تکرار در اردیبهشت ۹۳ درمزرعه آموزشی مجتمع آموزش عالی شیروان جهت داده برداری کشت شدند. صفات مورد نظر عبارتند از تعداد روز تا شروع گلدهی ،تعداد روز تا متوسط گلدهی، تعداد روز تا پایان گلدهی، فاصله تا اولین شاخه فرعی، تعداد شاخه های جانبی، تعداد طبق در بوته ،ارتفاع کل، وزن صد دانه، و عملکرد در واحد بوته می باشند.
بررسی مولکولی ژنوتیپ های گلرنگ
استخراج DNA ژنومی
۱۰ ژنوتیپ برای بررسی مولکولی با نشانگر ISSR مورد استفاده قرار گرفتند.در مرحله ساقه دهی (۱۰-۸ هفتگی ) برگها برای استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفتند.برگها بلافاصله در ازت مایع قرار داده شدند.پس از انتقال به آزمایشگاه با ازت مایع پودر و در ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
اندازه گیری کمیت و کیفیت DNA
برای اندازه گیری کیفیت و کمیت DNA از دو روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.در روش اسپکتروفتومتری جذب نوری محلول نوری رقیق شده DNA (به صورت ۱۵ میکرولیتر محلول استخراجی DNA +785 میکرولیتر TE ) در طول موج ۲۶۰ نانومتر اندازه گیری شد. در این طول موج مقادیر DNA به صورت زیر محاسبه شد.
۱OD= 50 ng/µl DNAدو رشته ای
در روش الکتروفورز ژل آگارز ۴ میکرولیتر از هر یک از نمونه های DNA به همراه یک میکرولیتر بافر بارگیری بر روی ژل آگارز ۵/۱ درصد در بافر TBA (0/5X)به مدت یک ساعت با ولتاژ ۷۵ ولت الکتروفورز شدند.سپس ژل با رنگ گرین ویوور رنگ آمیزی و عکس با بهره گرفتن از دستگاه UV ترانس ایلومیناتور مشاهده شد.
آغازگرهای ISSR
در این تحقیق ۱۰ آغازگر از منابع فانگ و رز (۱۹۹۷) و ناگاوکا و اوگی هارا (۱۹۹۷) انتخاب شد. برای رسم دندروگرام آنالیز بوسیله باندهای حاصل از ۵ پرایمر که تنوع خوبی داشتند انجام شد.مشخصات آغازگر ها در جدول( ۳-۱ )آمده است.
جدول ‏۳–۱:مشخصات آغاز گرهای ISSR مورد استفاده.