شکل ۴-۱: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr 66
شکل ۴-۲: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با بهره گرفتن از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی ۶۷
شکل ۴-۳: تصاویر ژل آگارز ۵/۱ درصد آغازگر ۱ با بهره گرفتن از مارکر bp 50 69
شکل ۴-۴: تصاویر ژل آگارز ۵/۱ درصد آغازگر ۲ با بهره گرفتن از مارکر bp 50 70
شکل ۴-۵: تصاویر ژل آگارز ۵/۱ درصد آغازگر ۳ با بهره گرفتن از مارکر bp 50 70
شکل ۴-۶: تصاویر ژل آگارز ۵/۱ درصد آغازگر ۴ با بهره گرفتن از مارکر bp 50 71
شکل ۴-۷: تصاویر ژل آگارز ۵/۱ درصد آغازگر ۵ با بهره گرفتن از مارکر bp 50 71
شکل ۴-۸: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل ۷۳
شکل ۴-۹: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده ۷۳
شکل ۴-۱۰: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75
شکل ۴-۱۱: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard 75
شکل ۴-۱۲: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی چندشکل ۷۷
شکل ۴-۱۳: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی ۷۸
فهرست معادلات
معادله ۳-۱: محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگر ۵۲
معادله ۳-۲: میزان چندشکلی نشانگر ۵۲
معادله ۳-۳: ارزشمندی باندها ۵۳
معادله ۳-۴: قدرت حل هر آغازگر ۵۳
معادله ۳-۵: میانگین قدرت حل هر آغازگر ۵۳
معادله ۳-۶: نسبت چندگانه موثر ۵۳
معادله ۳-۷: شاخص نشانگری ۵۴
معادله ۳-۸: ضریب تشابه جاکارد ۵۵
چکیده
نشانگر مولکولی ISSR به منظور جداسازی نژادهای زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهای کارگر با بهره گرفتن از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیق سازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز ۵/۱ درصد نمره‌دهی و آنالیز صورت گرفت. نتایج نشان داد که باندهای آغازگرهای مورد مطالعه شده در محدوده‌‌ی ۱۵۰ جفت باز تا ۱۰۰۰ جفت باز قرار دارند و بیشترین تعداد باند مشاهده شده مربوط به آغازگر ۱ و کمترین آنها مربوط به آغازگر ۳ و ۴ بوده است. آنالیز خوشه‌ای نژاد‌های مورد مطالعه آنها را در دو گروه اصلی قرار داد. در گروه اول فارس و در گروه دیگر که به دو زیر گروه تقسیم شده یکی شامل اصفهان و دیگری شامل مرکزی، خوزستان و کردستان، دو استان کردستان و خوزستان دارای بیشترین شباهت بودند. به نظر می‌رسد نشانگر ISSR بتواند به خوبی نژاد‌های زنبور عسل با منشاء مختلف را از هم جدا سازد.
واژه‌های کلیدی: نشانگر مولکولی، زنبور عسل، بهینه نمکی، تنوع ژنتیکی
فصل اول
مقدمه
مقدمه
براساس آمار سازمان خواربار جهانی بیش از هفتاد میلیون کلنی زنبور عسل در جهان وجود دارد که محصولات تولیدی آنها در راستای تامین نیازهای غذایی، دارویی و بهداشتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بعلاوه زنبور عسل با گرده افشانی گیاهان زراعی و باغی نقش بسیار مهمی در افزایش محصولات کشاورزی و پایداری محیط زیست ایفا می‌کند. در بین حشرات گرده افشان زنبور عسل بدلیل حمایت بشر، جمعیت بیشتر کلنی و جابجایی کلنی‌ها برای تولید محصول بیشتر و دامنه فعالیت وسیع‌تر، خصوصیات بیولوژیکی، رفتاری و مرفولوزیک خاص بهترین نقش را ایفا می‌کند و از اهمیت بالاتری برخوردار است. منطقه‌ی انتشار طبیعی زنبور عسل در جهان محدوده‌ی وسیعی است که از شمال به جنوب کشور های اسکاندیناوی، از غرب به داکار، از جنوب به دماغه امیدنیک و از شرق به کوه‌های اورال، مشهد و عمان محدود می‌شود، البته این حشره توسط انسان به سایر نقاط جهان نیز منتقل شده است (طهماسبی و همکاران، ۱۳۷۸). از زمان آشنایی بشر با زنبور عسل تولیدات آن بویژه عسل همواره به عنوان یک ماده‌ی غذایی ایده‌آل مورد توجه بوده است. عسل در فرهنگ عامه به عنوان یکی از شفابخش‌ترین فراورده‌های غذایی مطرح است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که محصولات کندو و از جمله عسل علاوه بر مغذی بودن‌، دارای اثرات درمانی نیز می‌باشد (توپچی و علمی، ۱۳۸۸). برای تولید بیشتر عسل نیاز به جمعیت‌های قوی می‌باشد و تولید جمعیت‌های قوی نیز در سایه‌ی مدیریت صحیح بر پایه‌ی دانش علمی ممکن می‌باشد. یکی از مسائلی که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتیجه تضعیف کلنی‌ها گردد، پدیده‌ی تلاقی‌های خویشاوندی می‌باشد که منجرب به افزایش هم‌خونی یا هموزیگوتی آلل‌های جنسی می‌گردد (Mayer, 1996).

تعیین وضعیت ژنتیکی موجودات زنده زیربنای اصلاح نژاد آنها در هر منطقه است برای تعیین این وضعیت و تفکیک توده‌های مختلف زنبور عسل در یک منطقه از روش های مرفولوژیکی، تنوع پروتئین‌ها و DNA نگاری استفاده می‌شود (طهماسبی و همکاران، ۱۳۷۶). برخی از تفاوت‌های موجود در ردیف DNAبین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‌هایی با اندازه‌های مختلف تجلی کنند که بروش‌های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه می‌گردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین می‌نامند‌ که از آن جمله می‌توان به سیستم آیزوزایم/ آللوزیم اشاره کرد. اما دسته‌ی دیگر از تفاوت‌های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می‌کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئین‌ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‌ها را می‌توان با روش‌های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. این نشانگرها که تقریباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزیه وتحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‌شود. طی سالیان اخیر شناسایی و بررسی تنوع ژنتیک در بین گونه‌های حشرات بر اساس نشانگر‌های مولکولی و روش‌های مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR بسیار متداول گشته است. ولی در کشور ما بررسی تنوع مولکولی در زمینه حشره شناسی بسیار کم انجام گرفته است. امروزه میکروساتلیت‌ها نقش مهمی در تعیین تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی جانوران و گیاهان و مخصوصاً حشرات ایفا می‌کنند. استفاده از نشانگر ISSR بیشتر جهت تنوع ژنتیکی گیاهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از این نشانگر جهت بررسی تنوع ژنتیکی راسته بالپولکداران به ویژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae ، راسته دوبالان و بال غشائیان در کانون توجه مجامع علمی قرار گرفته است(Luque, et al., 2002; Hundsdoerfer, et al., 2005; Radjab, et al., 2012).
اهداف کلی در این تحقیق عبارتند از :
بهینه سازی کاربرد نشانگر ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی زنبور عسل.
ارزیابی میزان خویشاوندی نژادهای زنبور عسل ایران نسبت به یکدیگر.
بررسی کارایی نشانگر ISSR در جداسازی و دسته بندی روابط خویشاوندی زنبور عسل ایران.
بررسی تفاوت و تشابه نتایج بدست آمده از مطالعه نشانگر ISSR و نتایج بدست آمده از خصوصیات مورفولوژیک زنبور عسل.
فصل دوم
بررسی و مرور منابع
۲-۱- تاریخچه زنبور عسل^[۱] و پرورش آن در جهان و ایران
قدیمی‌ترین زنبور عسل حفظ شده در کهربا در منطقه‌ای از میانمار برمه کشف شده است که عمر این فسیل به ۱۰۰ میلیون سال پیش در دوره‌ی ‌کرتاسه^[۲] باز می‌گردد که دوره‌ی زندگی دایناسورها بوده است، بنابراین قدمت زنبورها از قاره‌ی استرالیا نیز بیشتر است، البته این زنبورهای کشف شده دارای زندگی اجتماعی نبوده‌اند. نگهداری عسل توسط زنبورهای اجتماعی در دوره‌‌‌ی میوسن^[۳] در حدود ۲۰-۱۰ میلیون سال قبل گسترش یافته است (Campbell and Campbell, 2007)و کهن‌ترین نمونه زنبور عسل در موزه‌‌ی تاریخ طبیعی نیویورک مربوط به ۲۰ میلیون سال پیش است (سعادتمند، ۱۳۸۹).
نقاشی‌هایی بروی غاری در والنسیای اسپانیا کشف شده که در آنها برای رسیدن به لانه از نردبان و ظروفی برای نگه داشتن عسل به تصویر کشیده شده‌اند (شکل۲-۱).
شکل ۲-۱: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا
اولین تصویر از پرورش زنبور عسل مربوط به ۲۴۰۰ سال قبل از میلاد بدست آمده است که در آن تصویر زنبورها دارای ۴ پا و ۲ بال هستند و اینک در موزه‌‌ی لوور پاریس نگهداری می‌شود. مصریان باستان عسل را در مراسم مذهبی، تغذیه حیوانات مقدس و در بسیاری از تشریفات دیگر و حتی حفظ اجساد، مورد استفاده قرار می‌دادند(Crane, 2004) . دست نوشته‌هایی از مصریان باستان مربوط به ۳۰۰۰ سال قبل وجود دارد که فعالیت‌های پرورش زنبور عسل در آن به ثبت رسیده است (Campbell and Campbell, 2007).
در کتاب‌های فارسی و هندی از جمله کتاب ابن‌سینا و کتاب مقدس هندو به نام ودا که ۳-۲ هزار سال قبل از میلاد مسیح به زبان سانسکریت نوشته شده است، از زنبور عسل با احترام یاد می‌شود. شینو به اعتقاد پیروان مکتب هندو، به عنوان حامی و محافظ پرقدرت خدای دو، از خدایان سه گانه هندوئیسم بوده که به شکل زنبور عسل آبی رنگ در یک گل نیلوفر آبی مجسم می‌شود. خدای عسل بومیان هند شرقی به نام کاما است، که کمانی در دست دارد و زه این کمان متشکل از زنبورهای بسیار و درهم تنیده است (سعادتمند، ۱۳۸۹). در نسخه‌های خطی اروپائیان عسل به عنوان غذا، دارو، نوشیدنی و اهداف مختلف نگهداری مواد و همچنین در مراسم‌های مذهبی توصیف شده است. در بسیاری از فرهنگ‌‌ها عسل خوردنی نیست، اما یک نوشیدنی الکلی با بهره گرفتن از تخمیر قند عسل می‌سازند و مصرف می‌‌کنند.
تا حدود سال ۱۵۰۰میلادی زنبورها طی فرایند جمع آوری عسل در مکان زندگی خود کشته می‌شدند، پس از آن زمان اروپائیان تکنیک‌‌های زنبورداری را گسترش دادند.
زنبورداری در ایران سابقه‌ای دیرینه داشته و یکی از حرفه‌های اصیل و قدیمی ایرانی‌ها است، دشنه مفرغی منقش به شکل زنبور عسل متعلق به ‌۸۰۰ سال قبل از میلاد که در لرستان بدست آمده است وهم اکنون در موزه‌ی شهر بروکسل نگهداری می‌شود، معرف قدمت آشنایی ایرانی‌ها با این حشره‌ی مفید است. با جستجوی کلمه عسل و احتمالاً زنبور عسل در اشعار به خصوص شعرهای قدیمی می‌توانیم از قدمت و آشنایی ایرانی‌ها با زنبور عسل پی‌برد (آقایی نراقی، ۱۳۸۸).
ابن مقیصه از پیامبر اکرم(ص) نقل می‌کند که عسل درمان هر بیماری است و قران درمان تمام بیماری‌های ذهن است، بنابراین من به شما توصیه هر دو درمان عسل و قران را دارم (Campbell and Campbell, 2007).
۲-۲- ارزش اقتصادی زنبور عسل
آلبرت چی کاکس می‌نویسد: که هیچ جاندار دیگری به اندازه‌ی زنبور عسل به طرق مختلف به انسان خدمت نمی‌کند. زنبور عسل نقش بسیار مهمی در گرده افشانی بیش از ۹۰ گیاه (Al-Otaibi, 2008) در نتیجه بقا، گونه و همچنین افزایش کمی و کیفی محصولات آنها دارد، علاوه بر این زنبور عسل خود دارای تولیدات متنوعی مانند عسل، موم، بره موم، ژله، رویال و زهره نیز می‌باشد. تولید عسل مهمترین صفت اقتصادی زنبور عسل می‌باشد (مستاجران، ۱۳۷۹). امروزه نقش عظیم زنبور عسل در گرده افشانی گیاهان زراعی و باغی و احیای مراتع و بهبود محیط زیست به حدی شناخته شده و آشکار می‌باشد که تولیدات آن یعنی عسل و غیره را تحت شعاع قرار می‌‌دهد. اساساً نباتات از نظر گرده افشانی وابسته به حشرات هستند که در رأس آنها زنبور عسل قرار دارد، به عبارت دیگر گرده افشانی ۴۷ درصد از محصولات کشاورزی وابسته به زنبور عسل است، به همین دلیل ارزش اقتصادی زنبور عسل در دنیا ۱۰۰-۲۵ برابر ارزش عسل تولید شده در سال محاسبه می‌شود. به گفته‌ی Mc. Gregor پژوهشگر امریکایی در سال ۱۹۷۳، زارعین امریکا بیش از ۴۰ میلیارد دلار سود از افزایش محصولات زراعی در رابطه با گرده افشانی نباتات دگرگشن^[۴] داشته‌اند که نقش مهمی از این آزمایش به عهده‌ی زنبور عسل است. زنبور عسل جز گرده افشان‌های اصلی گیاهان روغنی خصوصاً آفتابگردان می‌باشد، نتیجه‌ی یک طر ح تحقیقاتی در همین رابطه در کشور امریکا که استقرار ۲ کندو به ازای هر هکتار آفتابگردان سبب افزایش چشمگیر محصول شده، به طوری که محصول بدست آمده در مزرعه تحت آزمایش ۵۰-۲۰ درصد بیشتر از مزارع شاهد بوده است (میراب‌زاده، ۱۳۷۲).
در ایران نزدیک به ۶/۴ میلیون کندوی مدرن با تولید متوسط ۳۸/۹ کیلوگرم عسل به ازای هر کندو در سال وجود دارد به این ارقام می‌بایست ۳۸۰ هزار کندوی بومی با تولید ۰۴/۴ کیلوگرم عسل برای هر کندو در سال افزود. بنابراین تولید عسل سالیانه کشور را در حدود ۴۵ هزار تن محاسبه نموده و ارزش ریالی آن را حدود ۸۰۰ میلیارد می‌دانند. حال چنانچه ارزش گرده افشانی را به آن بیافزائیم ارزش اقتصادی واقعی زنبور عسل بالغ بر ۲۰ تریلیون ریال خواهد بود (آمارنامه وزارت جهاد کشاورزی، ۱۳۸۹).
۲-۳- جایگاه سیستماتیک زنبور عسل
زنبور عسل به رده‌ی حشرات^[۵]، راسته‌ی بال غشائیان^[۶] و خانواده‌ی Apidae، جنس Apis و گونه A. mellifera تعلق دارد. راسته‌ی بال غشائیان که زنبور عسل به این راسته تعلق دارد، بزرگترین راسته پس از راسته سخت بال پوشان^[۷] است. این راسته دارای مفیدترین حشرات برای انسان‌ است، دارای گونه‌هایی است که از نظر انگلی^[۸]، شکارچی^[۹] و گرده افشانی^[۱۰] نقش مهمی دارد.
Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Sub Class: Insecta
Order: Hymenoptera
Super family: Apoidea